小鼠造血重建实验CD45.1VSCD45.2双阳性原因

decade911

大家好，
     最近在做小鼠的造血重建实验，就是将CD45.1标记的小鼠骨髓细胞移植入经辐照的CD45.2小鼠体内，不同时间点考察受体小鼠外周血中三系重建的结果。具体流式图如下：


问题在于：CD45.1VSCD45.2图中P21门内双阳性为何出现？且双阳性群体出现在淋巴细胞部分，且大部分为B220阳性（P10门）。而单染对照并没有出现。
比例大概在2-7%之间。是否是抗体的非特异性染色导致的？是否影响结果的可信度？
望大家解惑，谢谢！

niwanmao

你能先大致描述一下你们课题的目的吗？因为小鼠我没有做过，不知道你所谓的疑惑点问题在哪里

decade911

我昨天做了个验证试验，发现CD45.1的抗体染CD45.2的细胞大概有个5%的阳性，反之亦然。目测为非特异性染色出现的双阳性。考虑换两只CD45.1，CD45.2抗体试试。

niwanmao

decade911 发表于 2016-3-31 21:00
我昨天做了个验证试验，发现CD45.1的抗体染CD45.2的细胞大概有个5%的阳性，反之亦然。目测为非特异性染色出 ...

有没有将死细胞排除掉？

decade911

niwanmao 发表于 2016-4-1 12:12
有没有将死细胞排除掉？

加了死活染料了啊。反设门发现双阳性细胞主要在淋巴细胞群那个位置。

小憨

decade911 发表于 2016-4-1 15:53
加了死活染料了啊。反设门发现双阳性细胞主要在淋巴细胞群那个位置。

双阳性的细胞会不会是单核细胞呢？蓝色和绿色离得很近的。你试试染色前用Fc blocker封闭Fc受体造成的非特异性染色

小憨

另外我弱弱的问一下，B220其实就是CD45是吧？为什么会有CD3+B220-的细胞呢？

jwang

这个问题很复杂，目前没有人能回答，通常选择性忽视，只标donor cell。如果要双标。1 和。2，双阳部分会随着donor cell 比例增高而变多，我觉得可能是。1.2的融合细胞

decade911

小憨 发表于 2016-4-2 11:25
双阳性的细胞会不会是单核细胞呢？蓝色和绿色离得很近的。你试试染色前用Fc blocker封闭Fc受体造成的非特 ...

加了Fc block啊。

decade911

小憨 发表于 2016-4-2 14:51
另外我弱弱的问一下，B220其实就是CD45是吧？为什么会有CD3+B220-的细胞呢？

B220是CD45R。