流式孵育时间？

zwezwb

对于间接标记法流式检测细胞表面蛋白，孵育时间一般是多少，还有在孵育的过程中需要摇晃吗，特别是4度过夜的话；目前我在做的时候，存在的问题就是，室温3小时后，同型抗体阳性率基本小于1，但是阳性一抗的表达也很低（既往其他方法实验会高一些），但是4度过夜的话，同型抗体阳性表达率达到15%以上了，请问是什么原因呢？

niwanmao

孵育时间过长，会导致非特异性染色增强。你所谓的过夜后同型抗体阳性率增高，应该指的是荧光强度。
一般即使用间标法，也不建议4度过夜，不能以以前的Western blot方法来考虑流式孵育，至于多少时间为宜，我认为是最多半小时。

zwezwb

niwanmao 发表于 2016-4-18 13:53
孵育时间过长，会导致非特异性染色增强。你所谓的过夜后同型抗体阳性率增高，应该指的是荧光强度。
一般即 ...

倪老师，您好，谢谢您的回复，我尝试过孵育一小时，但是这样我的阳性一抗阳性率非常低，同型抗体阳性率高，是指在同型对照组，也出现了两个峰，不知道能否帮我看一下图？

zwezwb

这是我过夜得到的结果，如果采用半小时，出现阳性一抗结合特别低的情况，怎么办https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=OTYxNnwzZmU5YzliY3wxNzQ3MTUwNzcxfDB8

zwezwb

不知道您有没有关于这方面的书籍推荐，我看很多都是做表型，做周期，很少像我这种做法的

niwanmao

zwezwb 发表于 2016-4-18 16:12
这是我过夜得到的结果，如果采用半小时，出现阳性一抗结合特别低的情况，怎么办

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从你这些图来看，存在的问题是细胞死得太多，导致同型拖尾，而不是间接标记的问题。建议加上死活鉴别染料，排除掉死细胞，就不会出现这种情况。