th1、th2、th17染色问题

明寿明性 · 发表于 2016-4-23 15:23:31

各位老师好我最近在做小鼠脾脏的th1、th2、th2染色上遇到一些问题，ifn、il4和il17都没有染上。

抗体使用的是bd公司的CD4-FITC 、IFN-r-percp-cy5.5、IL-4-APC、IL-17A-PE
具体步骤：小鼠脾脏细胞制成悬浮细胞，过磁珠提取出cd4+细胞，计数后取每1ml的10的6次细胞加入刺激剂Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™（bd公司）2ul（使用过4ul、6ul效果一样），在37℃co2培养箱中6小时，使用的是Fixation/Permeabilization Solution Kit（bd公司）破膜固定20分钟（40分钟，50分钟都试过效果也差不多），到底是什么地方出了问题

同型

样品

niwanmao · 发表于 2016-4-23 21:57:02

你检测的话就没必要分选了嘛。我感觉不排除破膜剂问题，建议改用Beckman的Perfix nc试试。

明寿明性 · 发表于 2016-4-24 11:40:41

niwanmao 发表于 2016-4-23 21:57
你检测的话就没必要分选了嘛。我感觉不排除破膜剂问题，建议改用Beckman的Perfix nc试试。 ...

谢谢倪老师的回答，分选是为了取出的cd4细胞做wb等检测的，如果是破膜的问题的话，我已经按说明书上的延长1倍，再加大破膜剂的剂量和延长时间会不会有效果

niwanmao · 发表于 2016-4-24 13:26:04

明寿明性发表于 2016-4-24 11:40
谢谢倪老师的回答，分选是为了取出的cd4细胞做wb等检测的，如果是破膜的问题的话，我已经按说明书上的延 ...

破膜剂的效果，不是单纯由剂量和时间就能够决定的，如果破膜效果差，或者破不了膜，再大的量、再长的时间也没用。

Victorrwang · 发表于 2016-5-4 19:08:15

老鼠是正常健康老鼠还是疾病模型中的老鼠？你的实验目的是什么？
如果是正常老鼠，th2和th17应该不太可能检测到。
你想看到这些细胞群，可以purify naive t后做in vitro differentiation。

如果是相关的疾病模型，你可以做个expansion然后再测

bernie1023 · 发表于 2016-5-12 08:40:47

是不是没有加阻断剂啊？如果没有加的话，刺激后的细胞因子还是会分泌到胞外的，当然检测不到。

bernie1023 · 发表于 2016-5-12 08:43:49

另外，在检测细胞因子前，用CD69检测一下是否活化完全（只加刺激剂不加阻断剂，表面CD69阳性率在90%以上才算是刺激活化完全）。

niwanmao · 发表于 2016-5-12 12:38:41

bernie1023 发表于 2016-5-12 08:40
是不是没有加阻断剂啊？如果没有加的话，刺激后的细胞因子还是会分泌到胞外的，当然检测不到。 ...

他用的BD的刺激Kit里面已经包含了GolgiPlug这个阻断剂，所以个人觉得只能从染色的破膜上找原因。

Victorrwang · 发表于 2016-5-12 12:41:09

bernie1023 发表于 2016-5-12 08:43
另外，在检测细胞因子前，用CD69检测一下是否活化完全（只加刺激剂不加阻断剂，表面CD69阳性率在90%以上才 ...

如果用的是pma/ionomycin激活的话，可以通过细胞是否聚集成一个个集落来判断细胞是否被激活。

niwanmao · 发表于 2016-5-12 14:05:37

Victorrwang 发表于 2016-5-12 12:41
如果用的是pma/ionomycin激活的话，可以通过细胞是否聚集成一个个集落来判断细胞是否被激活。 ...

能用流式解决的，就不用形态

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[细胞因子检测] th1、th2、th17染色问题