胞内STAT蛋白磷酸化的疑问

rmanfour

近来在做胞内STAT1和STAT5的磷酸化流式细胞检测，但一直没有较好的结果。整个实验简单来说就是建立一个模型，检测药物对JAK激酶的抑制效果，JAK激酶的激活会引起下游几个STAT蛋白的磷酸化，通过STAT的磷酸化减少的效果来间接体现药物效果。

THP-1细胞用1640无血清培养基培养过夜后，用GMCSF100NG/ML刺激30min，用4%多聚甲醛室温固定30min，甲醇4度透膜30min，用20UL P-STAT5流式FITC抗体孵育30min。

流式图从左到右为E2未刺激组、E1刺激组、E3刺激组同型对照抗体。

问题1：同型对照跑到右边去正常吗？

问题2：如何能拉开刺激组和非刺激组的荧光？

不断调整实验快一个月了，结果都差不多，换过HL-60、U937细胞、固定透膜的试剂盒，还有几种抗体。

在站内翻到一些磷酸化方案，上述结果就是主要根据这个方案加上领导的建议做的。

http://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=2621&highlight=%E7%A3%B7%E9%85%B8%E5%8C%96

BD的Perm3透膜据说比较适合打开STAT的二聚体，正在发货路上，但我觉得对结果也没有很大帮助。

niwanmao

1、同型对照我以前很多帖子里面都强调过，不能作为设门参照，因为很难找到真正的“同型对照”，因为必须要与抗体同源、同型、同样结合能力，选对的可能性非常低，所以建议用已知磷酸化水平阴性的标本做对照。
2、要实现好的实验结果，首选要确保实验标本能够产生阳性结果，其次，用比较强的荧光素，例如PE标记的p-STAT5，再次，抗体用量要合适。

rmanfour

niwanmao 发表于 2016-5-27 15:12
1、同型对照我以前很多帖子里面都强调过，不能作为设门参照，因为很难找到真正的“同型对照”，因为必须要 ...

非常感谢您的解惑,我逐一排查一下实验