请问用PI染色排除死细胞是在细胞破膜和胞内染色之前吗？

vivic5015

我最近在做信号通路，对细胞破膜后进行胞内染色，因为死细胞有自身荧光，会干扰目标抗体荧光的检测，所以我想用PI染色来排除死细胞。那我应该什么时候进行PI染色？是在破膜之前吗？可是根据PI的protocol，要求染色后1h内检测，但我还要进行破膜和胞内染色，不可能在1h内完成。如果是胞内染色之后再染PI，我觉得细胞破膜后，PI染色肯定都是阳性，就没有意义了。那我应该怎么办？谢谢！

niwanmao

vivic5015 发表于 2016-5-28 14:19
谢谢！您说的这类染料可以区别破膜之后的活死细胞吗？能告诉我具体是什么染料吗？ ...

死活鉴别染料对于一些由于死细胞引起的非特异性荧光很强的时候比较有用，一般表面染色用PI够用，如果胞内，有不少商业化试剂，例如Live/dead（就是楼上说的胺类染料）、Ghost等。

niwanmao

胞内染色绝对不能用PI排除，因为膜已经破开了，死细胞和活细胞都一样对PI通透。

而表面染色可以在上机前加入低浓度PI，染1分钟马上上机检测。

decade911

不知道氨基结合的死活染料能不能满足你的要求。

vivic5015

niwanmao 发表于 2016-5-27 23:02
胞内染色绝对不能用PI排除，因为膜已经破开了，死细胞和活细胞都一样对PI通透。

而表面染色可以在上机前加 ...

谢谢！PI染一分钟就可以吗？我用的BD 的试剂，protocol说要15分钟。为什么有这么大的差距？是因为浓度不同吗？

vivic5015

decade911 发表于 2016-5-28 00:36
不知道氨基结合的死活染料能不能满足你的要求。

谢谢！您说的这类染料可以区别破膜之后的活死细胞吗？能告诉我具体是什么染料吗？

vivic5015

niwanmao 发表于 2016-5-28 21:26
死活鉴别染料对于一些由于死细胞引起的非特异性荧光很强的时候比较有用，一般表面染色用PI够用，如果胞内 ...

非常感谢！

bernie1023

Live/Dead要注意选择可固定的染料；也可以选择SYTOX系列的染料
还有Biogems的染料可以看一下http://www.bio-gems.com/catalogsearch/result/?q=viability+dye

decade911

vivic5015 发表于 2016-5-28 14:19
谢谢！您说的这类染料可以区别破膜之后的活死细胞吗？能告诉我具体是什么染料吗？ ...

先染后固定，具体你查查看吧，life和bd都有这类染料。染色pi一边上样一边加，这个我在某次讲座也听人这么推荐过。

guan

用PI染色时估测DNA含量时要求PI染色30min上机，如果样品量多的话，能一次性全加入PI吗？还是需要做一个时间梯度依次往后加PI吗？就是有可能这边在上机检测一些样品了，那边还的一边给其他的样品加PI？