Beckman 流式细胞仪-GALLIOS3激光十色，调电压、补偿操作问题

farmer000

Beckman 流式细胞仪-GALLIOS3激光十色，调电压及补偿怎样操作？平时找实验室管理人员调，但反复找，他比较烦，也不好意思再麻烦。想学点具体操作，自己做个protocl.
1.样品3个指标： CD4-PE.    IFNr-E660     IL17-E450   单染   +空白对照  +   全染  共5管。
2.新建空白散点图、柱状图
3.按要求选择通道，输入参数
4.跑空白管，点击调节按钮，将细胞全部压缩至左下象限——这样电压就调好了吗？


5.单染管调补偿是把阳性细胞调到那个位置才合适？标准怎么定？

farmer000

补偿是否为指标两两配对，如 CD4+FOXP4     CD4+CD45    FOXP3+CD45,分别调补偿
达到下图的水平，就OK了？

farmer000

补偿是否将两个单染样本混合后才能调出下图

niwanmao

空白管的电压调节只是参考，一般所谓的左下象限是并非固定区域，建议稍微调出来一些。
至于单阳性的标本如果有，那最好，如果没有，就用补偿微球实现，然后用标本微调。
我看你前面那个问题里面问的是测Treg和Th系列，这几类细胞应该分群很好，补偿也好调的。

farmer000

谢谢倪老师，我完全跟着别人走，自己一点都不懂。

farmer000

电压调节不懂。5个地方要调，是否1、2最重要，其他只是参考？

bernie1023

farmer000 发表于 2016-6-11 00:14
电压调节不懂。5个地方要调，是否1、2最重要，其他只是参考？

空白对照是用来调所有检测通道的电泳的。其中1、2是调节FSC和SSC的电压，使你的细胞显示在合适的位置。3、4、5用来调节荧光通道的电压，使未染色的细胞处在左边，但能把细胞都能显示出来。单染用来调节补偿，对于表达较弱的指标，可以用补偿微球，或者用相同荧光素标记的，但阴阳性能明显区分的。如IFNr-E660，可以用CD8-E660来调节该荧光素的补偿

farmer000

bernie1023 发表于 2016-6-12 10:07
空白对照是用来调所有检测通道的电泳的。其中1、2是调节FSC和SSC的电压，使你的细胞显示在合适的位置。3 ...

谢谢指点！！！

niwanmao

farmer000 发表于 2016-6-11 00:14
电压调节不懂。5个地方要调，是否1、2最重要，其他只是参考？

其它几个通道的电压也很重要。我过两天会分享一个Cyto 2016年会上的Session。

luecj1987

空白管  几个荧光通道的散点图上把细胞调节到全部显示出来不压线 且在左下角区域即可 只要你用到的通道都要调节     FSC和SSC调到细胞完全显示在你的视野内 并且使分群比较明显   我们以前CD4比较全  所以偶尔用它来调节补偿  但是一般都会根据经验  结合一些内参 平均荧光强度来调   另外补充一下  不用的通道最好关掉