Annexin V-FITC没有染上，原因求助

龙猫爱吃大白兔

大家好，本人最近刚开始做流式，但是今天做的结果是FITC一点都没有染上，能想到的原因有以下几个，拜托大家帮我分析一下,谢谢大家！
原因：1、说明书要求细胞消化重悬后用PBS洗两次，因为担心细胞数不够，所以只洗了一次。
           2、加入binding buffer重悬后，中途吃了个午饭，样品被放在四度半个多小时，然后才染的FITC和PI
           3、染色时先加的PI，后加FITC，试剂盒上的顺序是先FITC后PI
           4、之前用的旧的试剂盒染上了，这次用新的试剂盒没有染上，考虑还有可能是试剂盒的问题。两个试剂盒批次不一样。
我能想到的只有这些原因，可能还有别的原因，也请大家提出来，谢谢大家了。。/(ㄒoㄒ)/~~

niwanmao

没有和旧的做对比吗？一般更换试剂的时候都要进行新旧批次对比。
此外，第3个原因应该比较关键。

龙猫爱吃大白兔

niwanmao 发表于 2016-6-22 18:22
没有和旧的做对比吗？一般更换试剂的时候都要进行新旧批次对比。
此外，第3个原因应该比较关键。 ...

旧的试剂用完了，也没有特地留一点，没办法作对比。
如果是第三个原因的话，会有可能一点都没有染上吗，右边两个象限真的是一点细胞都没有

niwanmao

龙猫爱吃大白兔 发表于 2016-6-22 18:58
旧的试剂用完了，也没有特地留一点，没办法作对比。
如果是第三个原因的话，会有可能一点都没有染上吗， ...

要确定原因，只能再染一个试试咯，你说是吧。

lingxue

这几个月都有在给学生做凋亡。我觉得1、洗涤一次两次不是很重要。学生的基本都是贴壁细胞，经常都是洗掉培养液胰酶之后再用PBS洗一次就给我。关键是在加buffer前要把PBS去干净，我每次倒掉PBS后还会用200ul枪头再吸一次。2、这个没试过，明天我试试看。3、我们用的凯基annexin V-APC/PI试剂盒，我通常是两个试剂一起加。。4、也遇到过试剂盒的buffer不行，只能做实验去验证。

龙猫爱吃大白兔

lingxue 发表于 2016-6-23 09:26
这几个月都有在给学生做凋亡。我觉得1、洗涤一次两次不是很重要。学生的基本都是贴壁细胞，经常都是洗掉培 ...

谢谢，回答的很仔细很负责。我今天用双氧水诱导细胞凋亡，然后用昨天用的Annexin V-FITC/PI双染细胞，用荧光显微镜看了发现几乎没有绿光，要把曝光时间调到很大才能看到，红光很明显，而用借来的FITC染出来的图片却很漂亮，初步确定是试剂盒的问题。

niwanmao

龙猫爱吃大白兔 发表于 2016-6-23 19:56
谢谢，回答的很仔细很负责。我今天用双氧水诱导细胞凋亡，然后用昨天用的Annexin V-FITC/PI双染细胞，用荧 ...

找到原因就好。