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[结构和原理] 空白显示电压过低,单染却显示电压偏高。神奇还是见鬼.....

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发表于 2016-6-25 20:29:20 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
空白显示电压过低,单染却显示电压偏高。
都说我的电压低,建议调高。为什么单染不低呢?  


不懂不敢调。

空白对照

空白对照

单染样本

单染样本
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2016-6-25 20:32:04 | 显示全部楼层
如果以空白对照做参考设阈值,笑话就大了
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发表于 2016-6-26 11:02:51 | 显示全部楼层
farmer000 发表于 2016-6-25 20:32
如果以空白对照做参考设阈值,笑话就大了

不知道你染了什么抗体,什么荧光。
空白对照绝对不能做阈值参考,无论是单染还是多色,都存在荧光渗漏以及抗体的非特异性结合等各种背景增高的因素。
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发表于 2016-6-27 18:19:24 | 显示全部楼层
       楼主大概是用PE-CY7抗体标记破核膜的T细胞(PE-Cy7通道上一般就都是用这个染料了,PE-eFluor780好像很少有人用),楼主所说的那个单染应该是实验组阴性对照,看到这个样本信号比unstained tube高太多了,无所适从。
      细胞破膜后用抗体染色,抗体更容易与细胞内非常复杂的各类蛋白质非特异结合,目标蛋白的同源或结构近似蛋白,抗体滞留等等都会造成背景显著升高,这是显而易见的,相信楼主也明白。楼主的图显示电压的确偏低,且有可能单染样本的抗体是按照厂商推荐量直接加进去的。另外,请问楼主用的是什么机器?cytoflex?X坐标轴右侧仅仅只到10e3,这个动态范围应该是显示问题,不会是机器本就是这个样子,右侧肯定还有更高阶的对数范围没有显示出来,因此完全可以调高电压。
   胞内染色尽量避免使用PE-Cy7这类分子量巨大的荧光染料偶联抗体,既容易非特异性滞留,又难以到达抗原结合部位。而应该首选小分子量荧光染料偶联抗体,如FITC。(具体如何看实验设计和检测效果)
     以上只是根据有限信息进行的一些推断,仅供楼主参考。
      
     本不想回应解释,想想还是建议楼主心态平和的深入了解一下流式技术。另外,纠正一下,楼主的几篇贴子里总是提到“阈值”这个词,事实上楼主指的是阴性和阳性细胞的分群界限,在这些例子当中不应该使用“阈值”这个专用名词。

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