CFSE检测小鼠脾细胞中T细胞增殖（特异性抗原未产生激活刺...

qingfeng92

1.脾细胞的获取：取小鼠脾细胞，用BD的70um一次性细胞筛研磨，3mlACK红细胞裂解液冰上裂解5min，加入9ml 1640培养基，混匀终止，细胞计数

2.事先用锡箔纸将15ml离心管包好，保证避光孵育

3.用1ml 1×107cell/ml进行孵育，参考Quah B J C,Warren H S, Parish C R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and invivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester[J]. Nature protocols, 2007, 2(9): 2049-2056.加1.1ul 2.5uM的CFSE加入110ul 5%FBSPBS中，迅速加入细胞悬液中，迅速颠倒混匀，室温静置5min;加入9ml 5%FBS PBS,混匀，静置5min;300g,10min离心，弃上清，重复洗涤1次；用5ml 10% HI-FBS DMEM重悬细胞

4.阴性对照为正常培养基，阳性对照为1ug/ml ConA,实验组为抗原PA，10ug/ml；细胞放入12孔板培养，加入1ml细胞悬液，1ml 10% HI-FBS DMEM;即终密度为1×106 cell/ml，培养5天进行检测

5.注（1）培养之后，阳性对照能看到明显的增殖细胞团，实验孔未见明显增殖细胞团

      （2）从处死小鼠到铺板结束，时间较长，12h；因为还要拿脾细胞做其他实验

6.（1）阳性对照  正常，出现标准的手指峰

  （2）抗原刺激  没有增值细胞群

7.之前做的预实验：与这次试验的区别是24孔板，2×106cell/ml,1ml/well；从处死小鼠到铺板结束为5h；PA抗原刺激的效果也非常好

niwanmao

同样的细胞，阳性对照有，特异性抗原没有，首先确定一下该特异性抗原是否肯定能够刺激大量增殖？如果不能，是否需要选择其中某个亚群进行分析。还有也需要检查一下用来刺激的特异性抗原质量。

qingfeng92

niwanmao 发表于 2016-8-8 16:13
同样的细胞，阳性对照有，特异性抗原没有，首先确定一下该特异性抗原是否肯定能够刺激大量增殖？如果不能， ...

老师您好，我之前用2×106/ml的密度，24孔板，1ml/孔做的时候，特异性抗原也能刺激产生增殖细胞群；这1次用的是1×106cell/ml，12孔板，2ml/孔发现特异性抗原刺激没有产生增殖细胞群。之前看过您的1个回复说的是细胞密度要在死亡和抑制之间找到1个合适的值。不知道是不是密度过低导致无刺激或者特异性抗原刺激的孔细胞死掉了，而ConA刺激较强，细胞产生了增殖。

niwanmao

qingfeng92 发表于 2016-8-8 16:30
老师您好，我之前用2×106/ml的密度，24孔板，1ml/孔做的时候，特异性抗原也能刺激产生增殖细胞群；这1次 ...

特异性抗原刺激孔的流式检测图片可以传上来看看吗

qingfeng92

niwanmao 发表于 2016-8-9 11:19
特异性抗原刺激孔的流式检测图片可以传上来看看吗

帖子最开始20160713PA.PNG是预实验时特异性抗原刺激成功的图片；20160730PA.PNG是这1次失败的实验的FSC,SSC的图

niwanmao

qingfeng92 发表于 2016-8-9 14:18
帖子最开始20160713PA.PNG是预实验时特异性抗原刺激成功的图片；20160730PA.PNG是这1次失败的实验的FSC,S ...

特异性抗原刺激后，其它几个图如何？