这3点不注意，就可能毁了你的流式结果

niwanmao

流式结果不好，实际上因素很多，有标本保存方面的（细胞保存液可以解决：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html），有标本处理方面的，也有实验设计和数据获取、分析方面的，但是组合起来，以下三个方面可能最常见。


1、忽视补偿
有时候，你的染色方法、步骤无可挑剔，抗体和荧光素也都按照染色指数选了最佳的，是不是实验结果肯定就没有问题了呢？未必，荧光素之间的补偿如果不重视，就可能会导致错误的结果。

我们结合下面这几张图理解一下补偿对结果的影响。
在下图中，我们看到CD10＋CD13－的绿色细胞，这群细胞在CD45/SSC和FSC/SSC图上位于淋巴细胞区域，并且表达CD3，说明是T细胞，但这在正常T细胞上是不可能存在的。如果你认为CD10是真的阳性，那就可能会将其判断为T细胞恶性克隆。



然而，切换到CD10/CD3散点图，就会发现，其实是CD3和CD10之间的补偿没有调节好。



加大CD10减CD3的补偿，再切换回CD10/CD13散点图，可发现一切正常了。



那么，令人烦恼的补偿如何调节，怎么样算合理呢？请参见站内资料：
教你正确调节补偿（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5251-1-1.html）
为什么会存在荧光补偿？如何调节？看图！（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4768-1-1.html）
此外，选择荧光素的时候，尽量避免选用光谱重叠太大的荧光素。



2、自发荧光过强
既然叫自发荧光，那肯定就是细胞本身因素引起的，最常见的原因就是细胞内的成份（例NAD(P)H、胶原纤维、核黄素等），还有芳香族氨基酸（例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等）。
这些成份通常激发光波长在紫外光到蓝光范围（355～488nm），发射波长在蓝光到绿光范围（350～550nm），因此常常会干扰FITC、Pacific Blue等荧光素检测，降低了信号分辨能力，导致假阳性。在直方图，你就会发现不知道将门设在哪里。



因此，在实验检测前先跑一个相同状态的未染色细胞看看自发荧光水平还是有必要的，并且如果自发荧光强的话：
1、有条件的话，避免使用前述FITC、PB等通道荧光素，改用PE、PerCP-cy5.5、PE-cy5.5、PE-cy7等，甚至采用红光激发的荧光素APC等。
2、如果已经选择了FITC或PB，那么可考虑采用散点图设不规则门，不要用直方图（如下图）。


3、荧光素用了孪生兄弟
有不少荧光素，尽管名称不同，但实际上激发波长和发射波长基本相同，例如GFP和FITC、APC和Alexa Fluor647等等。如果你不小心将他们设计进了方案，而又需要将两种荧光区分开来，那么很遗憾，不行！
那么是不是这些孪生兄弟任何情况下都不能一起用呢？也不是，dump channel可以选择的，关于dump channel的概念，不了解的FLOWER可访问论坛查看详情：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5074-1-1.html