转染实验，检测凋亡

ps654321

@niwanmao
倪老师，您好。向您请教个问题：
我做转染实验（瞬转），转染成功的细胞表达GFP，且GFP荧光强度随剂量增加而增加。利用PI和Annexin-V-APC来检测细胞凋亡。
上机分组如下：
blankt
PI单染(调节FITC补偿）
AV-apc单染（未调补偿）
0 moi  双染
5 moi  双染(此时细胞表达GFP了，调节PI补偿）
10 moi 双染
20 moi 双染
您看我这个做法正确吗？我是否应该单独做个GFP的PI补偿？但考虑到随剂量的变化，平均荧光强度还是有明显改变的。
另外您觉得有更合适的荧光染料么？
下图我这边仪器信息，只有打勾的可以

实验结果下楼

ps654321

0：

5moi:

10:

20:

niwanmao

ps654321 发表于 2016-8-26 17:22
0：

5moi:

方案、荧光我觉得应该都没问题，但是这个Annexin V为什么分群这么不明显，似乎只是发生了荧光强度的偏移，所以感觉不是很好，你把20MOI的原始数据文件传上来看看。

ps654321

niwanmao 发表于 2016-8-28 09:05
方案、荧光我觉得应该都没问题，但是这个Annexin V为什么分群这么不明显，似乎只是发生了荧光强度的偏移 ...

已经把blankt av pi 0  20都打包上传了，还有个比较奇怪的是AV-APC单染与blankt相比荧光强度偏移非常明显，似乎APC的本底本身很高？
还麻烦您指教@niwanma
转染.rar (1.87 MB, 下载次数: 1)

2016-8-28 15:15 上传

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niwanmao

ps654321 发表于 2016-8-28 15:16
已经把blankt av pi 0  20都打包上传了，还有个比较奇怪的是AV-APC单染与blankt相比荧光强度偏移非常明显， ...

染色后的标本和空白标本之间不是这么比的，空白标本是做什么用的你知道么，主要是初步确定最小电压在什么范围，然后进行实测的时候可以在这个范围上下进行微调，等于说心里稍微有点底，而不是用于做阴性对照的。

对于AV/PI这种分群很好的实验，可以直接上实验管。从你给的数据看，FSC/SSC分为两群，FSC小的那群比例高，本以为是碎片，但看AV、PI表达，貌似又不像完全是碎片，不知道你的细胞刺激后是不是分成两群，下图是不设门的GFP和AV-APC的图，可以看出，AV＋的都集中在GFP－的细胞中，而且基本上都是FSC小的这类细胞。


如果把FSC小的这群去掉，只圈FSC大的，就看到如下表达，可以看到AV＋的少，而GFP＋、AV＋、PI＋的更少。

ps654321

niwanmao 发表于 2016-8-28 22:13
染色后的标本和空白标本之间不是这么比的，空白标本是做什么用的你知道么，主要是初步确定最小电压在什么 ...

实在感谢您抽出时间耐心解答，有醍醐灌顶的感觉，涨了知识， 但我还有些不解之处：
1、您说blankt作用是来确定最小电压的，我这边是艾森（您这边网站貌似还有过推广），它这个仪器电压貌似是固定的？我已经截图如下
2、AV/PI这种分群明显的实验直接上实验管，那您指的是直接上单染还是双染？
3、今天根据您前面知识，活学活用了，自己重头设了反向门，确实发现本以为是碎片的区域AV 表达有异常，但我回过头来看了下AV单染的细胞，AV+的细胞基本上都是FSC大的这类细胞。根据0孔设细胞形态门（其中机器采集细胞时有个对FSC-H阈值设定，大于50000），这类应该是碎片啊，这株细胞是pfeiffer，您可能熟悉，难道受刺激细胞皱缩，变小，跑到FSC小的那边去了？做凋亡会出现这种情况么？
4、您不设门的那幅图我有点困惑，您APC和GFP象限门的设定是根据细胞群，这样的话Q1-2代表的是APC+和GFP+,那么难道Q1-4只带表GFP+？因为Q1-1也就是APC+细胞群的APC-H阳性界址我看在104。

niwanmao

ps654321 发表于 2016-8-28 23:36
实在感谢您抽出时间耐心解答，有醍醐灌顶的感觉，涨了知识， 但我还有些不解之处：
1、您说blankt作用是来 ...

1、空白管对于可调电压的机器是确定电压范围，对于艾森的仪器，就没作用了，所以没必要用空白管。
2、当然直接上双染。
3、这个细胞株我不熟悉，但是根据你GFP转染的情况看，FSC小的那群还是应该去掉，如果是真实的细胞，FSC小的那群也应该有GFP＋出现才对。
4、我没根据空白管设置，因为根据空白管设置，AV＋接近100％，然而这几乎是不可能的事情。同时AV本身就分群很清楚，没必要设空白管，并且用空白管设置界限也不合理。

ps654321

niwanmao 发表于 2016-8-29 08:21
1、空白管对于可调电压的机器是确定电压范围，对于艾森的仪器，就没作用了，所以没必要用空白管。
2、当 ...

直接上双染？然后再圈PI/AV-APC门、调PI-FITC补偿？
步骤如下：
0moi：展开FSC-SSC，上机，圈群，开FITC-PE（调节FITC补偿），开FITC-APC，APC-PE，设定象限？
我再次回顾了我前几天做的另一株细胞，有个关于划门的问题，您一般划门会注意坐标轴的数值嘛？
如图：单峰图 显示20Moi转染效率大约95%,而0moiAPC-FITC图由于我最初设竖轴向右偏了点， 最终导致在20moi显示的转染率与单峰图不同，如图，这里显示68%的转染率（Q4-2+Q4-4) ，明显偏少。这是我后来根据单峰图调整后的图 。你看这样合理么？

另外我也把这次实验数据打包上传了，还请您指正。 另一株细胞转染.rar (963.72 KB, 下载次数: 0)

2016-8-29 15:44 上传

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niwanmao

ps654321 发表于 2016-8-29 15:38
直接上双染？然后再圈PI/AV-APC门、调PI-FITC补偿？
步骤如下：
0moi：展开FSC-SSC，上机，圈群，开FITC-P ...

转染效率的GFP分群也是很清楚的，不能用空白做设门对照。
要么直接按照分群设门，要么用空载质粒转染作为对照。从图中看，GFP＋应该不到50％。

ps654321

niwanmao 发表于 2016-8-29 18:01
转染效率的GFP分群也是很清楚的，不能用空白做设门对照。
要么直接按照分群设门，要么用空载质粒转染作为 ...

了解，但是您说GFP+不到50，您是指哪幅图