人外周血T细胞亚型分析

liujia860314

现在需要做人外周血PBMC检测Th1 Th2 Th17 Treg 细胞的流式分析，机器用的是 BD FACS Canto2. 有抗体如下：CD3-FITC, CD4-PE, CD8-APC-H7, IL-17-ALEXA FLUOR 647 ,FOXP3-ALEXA FLUOR647 , CD25-APC, IFN-GAMA-PE-CY7, IL-4-PE. 实验时需要PMA刺激，CD4会不会表达减少？如果这样的话是不是需要用CD3+CD8-来反标CD4， 如何进行更优化的抗体搭配？（简单的说就是实验测试管如何设计不同的抗体组合）。多谢！

niwanmao

你这是准备做两管？本来刚好8个抗体，可以搭配成8色。

PMA刺激后肯定会造成CD4下调，但如果好的抗体，其实还是可以分得开，实在染不好，可以染胞内CD4，就是跟IL-4等一起染胞内。

你的仪器应该是8色的，那么CD3-FITC, CD4-PB（或BV421）, CD8-PO（或BV450）, IL-17-ALEXA FLUOR 647 ,FOXP3 APC-cy7 , CD25-PC5.5, IFN-GAMA-PE-CY7, IL-4-PE可以试试。

liujia860314

niwanmao 发表于 2016-8-31 12:11
你这是准备做两管？本来刚好8个抗体，可以搭配成8色。

PMA刺激后肯定会造成CD4下调，但如果好的抗体，其实 ...

我的这些抗体都是BD的。您看我要是做成4管，每管染一种细胞是否可行。1. 用CD3，CD8反标CD4的。 Th17:CD3-FITC +CD8-APC-H7+ IL-17-Alex647 (FITC和Alex647是否有冲突？）Treg: CD3-FITC +CD8-APC-H7+CD25-APC+Foxp3-Alex647 (同样的问题FITC和Alex647是否有冲突？）Th1: CD3-FITC +CD8-APC-H7+ IFN-gama-PEcy7. Th2: CD3-FITC +CD8-APC-H7+IL-4-PE. 2.直接染CD4的：Th17: IL-17-Alex647 +CD4-PE . Treg: CD25-APC+Foxp3-Alex647 +CD4-PE. Th1: CD4-PE+ IFN-gama-PEcy7(这样两种荧光染料会不会有冲突？）Th2: CD4-PE+IL-4-PE (这样两种荧光染料会不会有冲突？）这两种方案哪种更可行呢？ 还是向您说的两管就可以？您说得染两管的方案不太明白。能再详细一些吗？谢谢啦

niwanmao

liujia860314 发表于 2016-8-31 15:03
我的这些抗体都是BD的。您看我要是做成4管，每管染一种细胞是否可行。1. 用CD3，CD8反标CD4的。 Th17:CD3 ...

CD3、CD8反标CD4会存在质疑。我前面说的是一管解决问题。

liujia860314

niwanmao 发表于 2016-8-31 15:40
CD3、CD8反标CD4会存在质疑。我前面说的是一管解决问题。

我的抗体CD4,IL-4都是PE的，而IFN-gama是PE-cy7,这样加到一管里面是否可以很好的区分不同的细胞？

niwanmao

liujia860314 发表于 2016-8-31 15:59
我的抗体CD4,IL-4都是PE的，而IFN-gama是PE-cy7,这样加到一管里面是否可以很好的区分不同的细胞？ ...

看我前面的荧光搭配方案

liujia860314

niwanmao 发表于 2016-8-31 16:09
看我前面的荧光搭配方案

老师，感谢您的及时回复。您前面的搭配方案确实可行，可是我的问题是我现在只有上面的那些抗体，如何用现有抗体搭配出比较好的方案呢？

niwanmao

liujia860314 发表于 2016-8-31 15:03
我的这些抗体都是BD的。您看我要是做成4管，每管染一种细胞是否可行。1. 用CD3，CD8反标CD4的。 Th17:CD3 ...

Th17:CD3-FITC +胞内CD4 PE+ 胞内IL-17-Alex647
Treg: CD3-FITC +胞内CD4 PE+CD25-APC+Foxp3-Alex647
Th1: CD3-FITC +胞内CD4 PE+ IFN-gama-PEcy7
Th2: CD3-FITC +胞内CD4 PE+IL-4（另外买一个PE-cy7或APC的）

liujia860314

非常感谢老师的建议！我还想问一下，我还用到补偿微球，微球染色的程序和细胞一样吗？也需要同细胞一样进行刺激固定破膜吗？如果是胞内的单染微球，比如IL-4的，这个微球我还需要在染IL-4的同时染CD3和CD4吗？

niwanmao

liujia860314 发表于 2016-9-1 11:31
非常感谢老师的建议！我还想问一下，我还用到补偿微球，微球染色的程序和细胞一样吗？也需要同细胞一样进行 ...

用补偿微球的话，只是大致了解补偿值范围，后面还是需要调节补偿的。处理方法就按照表面染色这样即可。