流式细胞检测结果往左偏移

小青菜

请教一下，如图我先做的表面染色 然后胞内染色    第一张图是我的空白对照 第二三是我的未刺激组合刺激组  然后 实验组比空白组往左偏移好多
1.有人说是第一张图非特异性太高  。 我分实验组之前是会将细胞预混一下然后进行分组 细胞状态 每一个应该都是一样的
2.有人说电压飘了  但是我一共做了十组，只有三组往左偏移明显 其他组正常
想请问一下 这种左偏如何可以避免？
  胞内染色步骤：破膜之后，洗涤细胞时是否要加大离心速度，破膜的细胞会自己恢复么，我是二步法染色胞内，所以我的一抗是和破膜一起做的，那我的二抗加入的时候，是否也要加入破膜剂？
希望大手们的解答。

niwanmao

空白对照用的是什么细胞？

小青菜

niwanmao 发表于 2016-9-20 18:29
空白对照用的是什么细胞？

空白组和实验组都是采用的PBMC细胞，空白对照组和实验组唯一的区别就是没加细胞因子抗体

niwanmao

小青菜 发表于 2016-9-20 18:59
空白组和实验组都是采用的PBMC细胞，空白对照组和实验组唯一的区别就是没加细胞因子抗体 ...

首先，需要明确一下，空白细胞不是用来作为设门参照的，而是用于确定电压大致范围，上过就算数，不用再去用，所以无论它在什么位置，不需要管它。
其次，设门建议用未刺激组作为阴性对照。

至于你问的为什么会发生这种变异，因为尽管都是PBMC，胞内细胞因子染色时，含固定破膜步骤，会造成细胞形状发生变化，同时也会造成荧光改变，所以会和什么都不处理的空白对照相差甚大。如果你把空白对照也进行固定破膜，你就会发生细胞群也会向左漂。

小青菜

niwanmao 发表于 2016-9-20 19:34
首先，需要明确一下，空白细胞不是用来作为设门参照的，而是用于确定电压大致范围，上过就算数，不用再去 ...

我是这么想的①空白对照组只是不加细胞因子抗体，其他和实验组一样也会有固定破膜的操作
之所以设置这个组我是想观察 有些细胞因子不刺激体内也会有分泌 所以空白组应该和未刺激组也会有差距
②我做实验的目的是筛选 比较同一细胞因子的不同抗体那个比较优秀 所以背景值需要尽量低  我想通过比较空白和未刺激  未刺激和刺激 这样两两比较来筛选 比较好的细胞因子抗体的

niwanmao

小青菜 发表于 2016-9-20 19:51
我是这么想的①空白对照组只是不加细胞因子抗体，其他和实验组一样也会有固定破膜的操作
之所以设置这个 ...

1、用不加抗体的空白对照本身就是一个错误，你认为不刺激也会有分泌的话，应该是用未刺激组＋FMO作为对照，可在站内搜索“对照”了解更多信息。
2、背景值也不能通过空白对照了解，原因同上。