流式分选后细胞存活率问题

steven

各位大家好

现在在做肝脏星型细胞的流式分选，但是分选后的细胞活性很不好，分选后17%FBS的DMEM培养一天后细胞大部分都浮着，聚成一堆不贴壁。
分别培养分选之前和分选后的细胞，明显发现分选前的细胞状态好，易于贴壁和变形。
现在有以下疑问，请有经验的同行帮忙解答。什么原因导致细胞存活率低呢？如何提高细胞的活性呢？
由于分选的是刚分离的新鲜肝星状细胞，属于未激活状态，分选后的细胞不贴壁是因为分选过程中受损伤了还是因为没有其他的细胞协同刺激自己不能活化呢？
具体参数应用的BD Aria III，100um喷嘴，速度1-3，利用375nm自发荧光分选，纯化模式，时间一只流式管2小时左右。
上样管用的是含2%FBS的无酚红a-MEM，全程4度保存，收集管用的是含10%FBS的DMEM。
分选后用Trypan blue检验活性，最高50%，而且培养后似乎死的更多。。。
另外之前用过PI排除过死细胞，但对结果好像影响不大，同时PI会对细胞活性有影响吗？
谢谢大家帮忙

niwanmao

steven 发表于 2016-9-30 09:27
红的是死细胞 sytox orange染色的死细胞。
分选后，看着还有40-50%活细胞，培养一换培养基就不剩啥了。。 ...

我在想，死活染色在分选前后没明显差异，但培养后细胞不好，可能还是跟培养条件有关，而不是分选，因此，我个人觉得应该还是不考虑分选的条件问题，而是培养。

niwanmao

从你的分选条件看，应该是可以的，看来分选还是对星型细胞是不是损害还是太大了。
我觉得你可以按照下面这篇文章中的流程，不用分选，单纯用离心＋OptiPrep就可以很好的分离出HSC。



文献来源：Liu W, Hou Y, Chen H, Wei H, Lin W, Li J, Zhang M, He F, Jiang Y. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 2011 Sep;11(17):3556-64.

在线阅读原文请点击：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTEwMjV8ZDQwZWQ1NDV8MTcxNDYwNjc1MXwwfA%3D%3D

steven

谢谢老师的回复。
我的这个分选就是在梯度密度离心后进行的。
因为梯度离心后无论是荧光显微镜查看还是用标记物标记，纯度都不高，所以选择再次分选。
文献报道的纯度都很高，但是实际操作起来，细胞间的粘连还有其他因素造成纯度不高。
这是分选前后的对比，梯度离心后还是有很多其他细胞混杂。红色是sytox orange，蓝色自发荧光。

niwanmao

steven 发表于 2016-9-29 10:08
谢谢老师的回复。
我的这个分选就是在梯度密度离心后进行的。
因为梯度离心后无论是荧光显微镜查看还是用 ...

红色的是什么细胞？非星型细胞？用Sytox orange就可区分开？

steven

niwanmao 发表于 2016-9-29 20:41
红色的是什么细胞？非星型细胞？用Sytox orange就可区分开？

红的是死细胞 sytox orange染色的死细胞。
分选后，看着还有40-50%活细胞，培养一换培养基就不剩啥了。。。
分选前后还是可以明显的看到细胞纯度提升的，所以分选似乎不能缺少，不知怎么能提升细胞活性。
谢谢老师指导

steven

niwanmao 发表于 2016-9-30 14:58
我在想，死活染色在分选前后没明显差异，但培养后细胞不好，可能还是跟培养条件有关，而不是分选，因此， ...

相同培养条件下，分选前的细胞正常贴壁，分选后的几乎不贴壁。
所以说不知道是不是分选影响了细胞活性，375的近紫外线不会一瞬间杀死细胞吧？！
或者是星型细胞活化需要其他细胞的联合作用，自己单独培养不能活？应该不至于吧，加了胎牛血清的。。。

niwanmao

steven 发表于 2016-10-3 18:46
相同培养条件下，分选前的细胞正常贴壁，分选后的几乎不贴壁。
所以说不知道是不是分选影响了细胞活性，3 ...

这个我觉得不会，如果分选时的激光杀死了细胞，那么分选后死活染色应该可以直接反映出来。
我觉得分选之后应该可以适当增加胎牛血清的量，当成刚复苏后的细胞培养。

steven

niwanmao 发表于 2016-10-4 09:17
这个我觉得不会，如果分选时的激光杀死了细胞，那么分选后死活染色应该可以直接反映出来。
我觉得分选之 ...

谢谢老师一直的耐心解答。
分选后的细胞用17%的血清培养，应该浓度足够高了，但是还是不行。
还有一点，随着培养时间的延长，似乎悬浮的细胞越来越多了。
有人说细胞分裂的时候会从贴壁变成悬浮状态，真是这样吗？刚刚培养2天，细胞应该是以贴壁生长为主吧，会这时候分裂吗？还是说贴壁的细胞死的越来越多了。。。。

niwanmao

steven 发表于 2016-10-5 09:11
谢谢老师一直的耐心解答。
分选后的细胞用17%的血清培养，应该浓度足够高了，但是还是不行。
还有一点， ...

不会这样的，变成悬浮之后不能再贴壁就说明细胞出问题。

HSC的纯化和培养我也没有实际经验，我刚才找到一篇Nature Protocol上的文章，我觉得跟你做的几乎一模一样，你参考一下：High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers