凋亡诱导后，细胞周期只有一个峰了。

燕仔响当当

操作流程：

肿瘤细胞H460，凋亡诱导24h。

胰酶+EDTA消化，收集细胞，PBS洗涤1次

0.3mLPBS重悬，逐滴加入-20预冷无水乙醇，充分混悬

-20存放48h

取出后，离心去除乙醇，PBS洗涤1次

PI（2ug/mL）0.4mL+RNA酶（20mg/ml）0.5ul，4℃染色30min

上机前300目过滤

问题：

1。对照组（第三张）S期不明显，CV值大于10。

     是不是因为凋亡诱导时间太长，细胞受损严重，DNA损失大小不一，造成的CV值过大

2。处理组（第四张）只有一个峰了竟然，而且位置哪里也不符合，很奇怪，想不明白。难道诱导凋亡的同时还可以周期阻滞？全S期？

处理组（第四张）只有一个峰了竟然，而且位置哪里也不符合，很奇怪，想不明白

control2

control

燕仔响当当

对了，PI的浓度有点低，但是还是染出来了，应该不是PI浓度的问题吧

niwanmao

我看你的帖子，似乎前面两个图没有复制过来，只有后面两张图。后面这两张图挺好啊。

燕仔响当当

niwanmao 发表于 2016-9-28 18:20
我看你的帖子，似乎前面两个图没有复制过来，只有后面两张图。后面这两张图挺好啊。 ...

哎呀，对不起对不起倪老师，这是前面两张圈门的图，后面两张是周期的直方图没有粘过来，我粘一下哈！

燕仔响当当

哎呀，对不起对不起倪老师，这是两张对照组圈门的图，药物处理组的圈门的二维点图，和对照组差不多，就不贴了。后面两张是周期的直方图没有粘过来，我粘一下哈！
我这个PI染完后没有洗，直接离心后PBS重悬就上机了。可能会有影响吧

niwanmao

燕仔响当当 发表于 2016-9-29 20:23
哎呀，对不起对不起倪老师，这是两张对照组圈门的图，药物处理组的圈门的二维点图，和对照组差不多，就不贴 ...

看你顶楼那几个图挺好的啊，为什么最后一个图单峰了？是不是坐标选错了？

燕仔响当当

昨天换了细胞株colo205，重新做了一次，这次PI染色后洗了洗，就有周期的规律了，但是我这个药物是诱导凋亡的，在图里却并没有subG1峰。。。Annexin V双染是可以看到早期凋亡的。
问题 1：洗一次的影响就这么大么
问题 2：怎么木有凋亡峰捏

niwanmao

燕仔响当当 发表于 2016-9-29 21:30
昨天换了细胞株colo205，重新做了一次，这次PI染色后洗了洗，就有周期的规律了，但是我这个药物是诱导凋亡 ...

1、洗涤应该不是关键吧，而是PI浓度吧？你的PI浓度似乎太低了，一般20～40ug/ml。
2、有时候Annexin V结果和SubG1对不上，因为前者在早期凋亡，而后者则是晚期凋亡

燕仔响当当

谢谢倪老师每次都回答我弱弱的问题！
确实第二次做的时候，PI浓度提高到了20ug/uL。周期规律就好些了。
但是第一次的时候，对照组还是染出来了的，难道处理组DNA损伤了反而不好染色了？
不过以后还是要按常规浓度染色才能对得起一番劳动。以上只是个小小的疑问而已，嘿嘿嘿

niwanmao

燕仔响当当 发表于 2016-9-30 12:44
谢谢倪老师每次都回答我弱弱的问题！
确实第二次做的时候，PI浓度提高到了20ug/uL。周期规律就好些了。
但 ...

科研无绝对，低浓度是有可能染上少量细胞，跑出一定的峰，但更多时候是染不出来。至于对照组染出来了，这说明对照组可能乙醇固定和后面的破膜处理的比较好一些，并不是说哪个不好染了。