〖流式细胞仪优化〗滴定所有抗体

niwanmao

无论是临床上还是科研中使用抗体，均不能过于依赖厂家给出的滴定用量，他们不知道你们用在什么实验条件下，推荐用量大多数情况下明显高于最佳用量。用量过大之后，并不仅仅意味着成本高了，很多人可能不知道，抗体用量过大，也可能会导致分群欠佳，因为随着抗体用量增多，会出现一个饱和平台，继续增加用量，阳性群不会继续增强，而阴性群本底荧光增强、CV值进一步增大，见下图（Margaret Beddall）：



滴定的准则：
1、滴定的浓度范围尽量大，不要只选择2～3个。
2、滴定条件要和实际的实验条件一致，例如你在室温下滴定抗体，但有一个实验中细胞染色是在37度下，那么在37度下也要滴定一次。
3、滴定和实验要使用同一种细胞。

怎么看滴定结果呢？
如下图，先根据阳性峰的中心点绘制出一条饱和曲线，然后找到饱和平台的第一个点（图中红色箭头），再结合阴性群的分布，可认为是获得最强荧光、最佳分离系数的抗体用量。不过实际上对于CD3等荧光较强的抗体，该最佳用量以下2～3个用量点都是可以在实际实验中使用，因为尽管分离系数并没有最佳用量好，但阴性峰的CV值要小很多。



最后，对抗体滴定的现实性问题谈一下个人看法，欢迎拍砖：
1、设置十几个梯度滴定是最好的滴定方法，但对于我们国内用户可能比较残忍，本来抗体就贵，多滴几个马上就几百块钱没了，但对于临床上，我觉得还是有必要的，起码做个4～5个梯度总要的。
2、如果某个抗体表达很难找到高表达的细胞，这可能又是一个难题，我个人的意见此时还是只能参照厂家建议，不知道FLOWER们有没有什么好的解决办法？
－－EOF－－

yuanli

能请问一下倪老师，您的这个图是怎么做出来的么？阳性峰是用什么表示出来的呢?