4种荧光，轻松区分G1、S、M、G2四个细胞周期

niwanmao

细胞周期的研究不仅对于研究生理、病理很关键，而且在各种药物实验中均是十分重要的监测指标。
Nature Methods杂志2016年10月31日在线发表的《Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases》给我们带来了一种新的报告系统（Reporter System，所谓报告系统就是多个报告基因联合，目的是为了更好地指示细胞功能或结构），通过该系统，在荧光延时成像中，轻松而明确地观察到G1、S、M、G2四个细胞周期的变化。

对于这些新的事物，我习惯直接少废话，看图看疗效。

这个系统由4种报告蛋白组成，这4种报告蛋白均可激发出不同的荧光，分别对应的是蓝光、绿光、黄光、红光（如下图）：


图a、报告蛋白mTurquoise2–SLBP18–126、Clover– Geminin1–110、mKO2–Cdt130–120、H1.0–mMaroon1指示4个细胞周期的观察示意图，在各周期中，每种荧光蛋白的表达量会出现不同的变化。


图b和图c、Fucci4系统的延时成像示例，在Hela细胞中，母代分裂为子代，从子代分裂为孙代，mKO2、mTurq2、Clover、mMaroon1四种蛋白会呈现规律变化：
G1期mKO2＋、mTurq2＋、Clover－、mMaroon1＋
S期mKO2＋、mTurq2＋、Clover＋、mMaroon1＋
G2期mKO2－、mTurq2＋、Clover＋、mMaroon1＋
M期mKO2－、mTurq2－、Clover＋、mMaroon1＋
（以上是我看图总结的，未仔细看正文，有兴趣的同学可点击”阅读原文“，看看是不是这样）。



图d和图e、通过前面这样的组合判断，就可以在对照和双嘧啶阻滞实验中轻松计算出各个周期细胞的比例了。


看了这些图，我就在想：这些荧光显微镜能观察的指标，用流式一样可以测到，而且快速检测很多细胞，使得统计比例更准确。只是报告系统可能需要商品化才方便吧，希望这些好东西能早日普及。

有兴趣的同学，请点击下列图标在线阅读PDF，无需下载，并且支持划词翻译：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTEzMTF8MTZkMzc3OWV8MTczMjIzMTQ0NnwwfA%3D%3D
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happyeday

真是一个好贴。
为了学习搜索到了以下内容，希望对大家有所帮助（链接见http://www.ebiotrade.com/newsf/2009-11/20091124173156134.htm）：
2008年，日本科学家Miyawaki等开发出荧光泛素化细胞周期指示剂（缩写为FUCCI），这是一种基于荧光蛋白的探针，它将红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP）与不同的细胞周期因子Cdt1和geminin融合。这样，Cdt1和geminin就被泛素连接酶E3泛素化，继而降解。泛素连接酶的时间调节产生了Cdt1和geminin的双相周期。
在G1期，geminin降解，只能看到带有RFP的Cdt1，因此G1期的细胞显示出红色荧光核。在S、G2和M期，Cdt1降解，只剩下带GFP的geminin，因此细胞核呈绿色荧光。在G1/S过渡期，随着Cdt1水平下降和geminin水平升高，两种蛋白都存在，绿色和红色的叠加产生黄色荧光。红色-黄色-绿色，这种动态的颜色变化呈现出细胞周期和分裂的过程。
Invitrogen将上述研究成果商业化，并结合了强大的BacMam基因导入系统，开发出使用更为方便的Premo™ FUCCI Cell Cycle Sensor。这种预包装的试剂是即用的，避免了纯化质粒的麻烦，也省去了脂质体等转染试剂。
BacMam生物通以前介绍过，是一种改造过的杆状病毒，能将荧光蛋白导入胞内，不仅适合多种细胞类型，包括原代细胞和神经细胞，而且无明显的细胞毒性。另外优化起来也相当容易，只需增加或减少病毒就能控制表达水平。到目前为止，已有90多种细胞类型经过实验，可被BacMam技术有效转导，不过造血细胞和巨噬细胞除外。
整个流程也很简单：在细胞中加入试剂，放置1-2小时，再用BacMam增强剂（试剂盒中已提供）处理1-2小时。洗涤后过夜孵育，让荧光蛋白表达，然后就可以利用传统的荧光显微镜观察细胞周期了。
Premo™ FUCCI Cell Cycle Sensor可用于细胞周期进程的成像，并可评估药物、siRNA或其他因素对细胞周期的影响。Cdt1-RFP和geminin-GFP的荧光可耐受4%甲醛的固定及0.1% Triton X-100的通透处理，因此标记后的细胞可用抗体等来处理。