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同型对照荧光比抗体强,咋办?阻断!

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发表于 2016-11-9 18:24:26 | 显示全部楼层 |阅读模式

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在各种流式细胞术检测中,正确区分阳性和阴性十分重要。要实现阳性细胞群的良好区分,首先要滴定抗体,选择既有高噪比又有低背景荧光信号的用量。
那么,背景信号都是哪里来的呢?仪器的电子噪音、细胞自发荧光、多色流式时通道之间的荧光渗漏,以及抗体的非特异性结合。前三种背景荧光无法完全避免,可以在事后方便得通过一些方式消除,但单克隆抗体非特异性结合到白细胞的Fc受体,就需要事先就做好工作了。


抗体的非特异性结合究竟指的是什么呢?
我们应该了解,白细胞(除了T细胞)表面大多表达CD16、CD32、CD64等Fc受体,这些受体可与各种抗体的Fc端结合,所以会出现非特异性荧光。其中以单核细胞、巨噬细胞尤甚。
如果不对这些细胞的Fc受体进行阻滞,你的实验结果就可能会出现假阳性或者奇怪的结果(也就是很多人在流式中文网论坛www.flowcyto.cn上提问过的同型对照比抗体荧光强)。
在过去几十年,同型对照被广泛用于反映非特异性结合背景,这是基于假设同型对照和抗体完全同源、同荧光、荧光素/蛋白比例相同。但实际上很难找。目前,同型对照的价值受到了很多人的质疑,有人认为,使用Fc阻断,就可以消除非特异性结合,也就是说能够完全取代同型对照。

来看看下面的对比图,你就能了解Fc受体阻断的重要性了。

图1、空白标本,就是未染色,也未进行Fc受体阻断。选择的是CD45+的白细胞,并且排除了死细胞和粘连体。各通道荧光均低水平。
1.jpg


图2、分别标记IgG1 Alexa Fluor647、IgG2a FITC、IgG2b PE三种同型对照,选择的同样是CD45+的白细胞,并且排除了死细胞和粘连体。可见其中一类细胞IgG1和IgG2a背景荧光特别强,反设门发现,这类细胞主要是CD14+的单核细胞。而有意思的是,IgG2b同型对照则背景荧光低很多。
2.jpg


同3、使用100ug/ml人IgG阻断后,别标记IgG1 Alexa Fluor647、IgG2a FITC、IgG2b PE三种同型对照,选择的同样是CD45+的白细胞,并且排除了死细胞和粘连体。此时,背景荧光恢复到与空白标本相似的水平。
3.jpg


现在明白了Fc受体阻断的重要性了,那么我应该怎么操作呢?方法其实很多,Morten N. Andersen在Cytometry A 2016年9月发表的《Elimination of Erroneous Results in Flow Cytometry Caused by Antibody Binding to Fc Receptors on Human Monocytes and Macrophages》一文中已经帮我们做了大量测试(如下图),从测试结果看,T、B、NK细胞阻断前后背景荧光变化不大,说明不进行阻断也没关系,但单核细胞就必须进行Fc阻断,结果理想的Fc阻断试剂有:
(1)商品化的Fc Block(25ug/ml或10ug/ml);
(2)2.5%或10%的人血清或小鼠血清;
(3)100ug/ml的人IgG。


4.jpg 5.jpg 6.jpg


看到最后,你可以在想,哎呀,还要订阻断剂,多花钱了。如果不想阻断,又想获得好结果,那么就选择抗体的时候避免IgG1亚型和IgG2a亚型的,尽量找IgG2b亚型的抗体。如果找不到,那就没办法,你必须要买前述的阻断剂了。

原文请点击下列图标在线阅读,支持划词翻译:
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTE0NTJ8YjY2MWJiYzdhNjBhZWIyNWMzYmRlMmVjYTMxZjUyNDB8MTY1MzA3NjQzMw%3D%3D&request=yes&_f=.pdf
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发表于 2019-1-18 11:03:01 | 显示全部楼层
老师你讲的好好!我实验就是又用阻断剂又做同型对照,之前一直不明白,看了你的文章恍然大悟。因为我的细胞是单核白血病细胞,染色抗体又用的IgG1。谢谢老师~
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发表于 2016-11-17 14:36:47 | 显示全部楼层
那么是淋巴细胞都不需要经过阻断吗?
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 楼主| 发表于 2016-11-17 15:17:17 | 显示全部楼层
特勒兮兮 发表于 2016-11-17 14:36
那么是淋巴细胞都不需要经过阻断吗?

淋巴细胞还好
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发表于 2016-12-1 09:21:09 | 显示全部楼层

老师你好,我如果做全骨髓细胞和外周血细胞呢,需要阻断吗?
还有使用阻断剂后是不是就不需要做同型对照了?
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 楼主| 发表于 2016-12-1 11:19:53 | 显示全部楼层
jiangmeng 发表于 2016-12-1 09:21
老师你好,我如果做全骨髓细胞和外周血细胞呢,需要阻断吗?
还有使用阻断剂后是不是就不需要做同型对照 ...

看你要分析什么群体,阻断后理论上可以不用同型对照。
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发表于 2016-12-1 18:54:44 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-12-1 11:19
看你要分析什么群体,阻断后理论上可以不用同型对照。

好的,谢谢您。还有一个问题,我看到许多好杂志的文章大部分都是用的同型对照作为设门的依据,做了同型对照还需要进行FMO(好像看到做这个文章不多)吗?
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 楼主| 发表于 2016-12-1 19:31:28 | 显示全部楼层
jiangmeng 发表于 2016-12-1 18:54
好的,谢谢您。还有一个问题,我看到许多好杂志的文章大部分都是用的同型对照作为设门的依据,做了同型对 ...

这两种概念站内以前发过不少帖子,在此不再详述,可自行搜索。
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发表于 2016-12-19 03:24:22 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-12-1 11:19
看你要分析什么群体,阻断后理论上可以不用同型对照。

我主要分析的相关的抗体是 lineage, CD34, SCA-1, C-kit, PECAM, CD133 等抗原。  阻断的话使用   Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) 这个可以吗?用FBS是不是效果不是特别好?
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 楼主| 发表于 2016-12-19 08:15:43 | 显示全部楼层
jiangmeng 发表于 2016-12-19 03:24
我主要分析的相关的抗体是 lineage, CD34, SCA-1, C-kit, PECAM, CD133 等抗原。  阻断的话使用   P ...

可以。效果肯定是Fc Block好。
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发表于 2018-3-8 15:01:48 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-12-19 08:15
可以。效果肯定是Fc Block好。

倪老师,这个数据的文献能分享吗?
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