〖破案〗这类细胞CD4表达强度比阴性群还低，怎么回事？

niwanmao

用“破案”的形式，看看我们流式界隐藏在全国各地的福尔摩斯或者柯南究竟有多少？
＝＝2016年11月15日案件＝＝
来看下面这个图，是从一个多色实验中截取的一张CD69/CD4散点图，从这张图中，我们看到中间密度最大的是CD4阴性细胞群，但在阴性细胞下方，还有一类细胞CD4表达强度比阴性群还低，这是怎么回事？请跟贴回答。



＝＝2016年11月16日罪证陈列&新发案件＝＝
看来咱们的FLOWER中隐藏了许多福尔摩斯，案件很快就破了。确实，这就是多色实验中（常见于8色、10色等），相邻通道补偿过大，在另外的通道上就会显示成这样。
上面这个图的原因就在于CD4/CD57的补偿过大：



将CD4/CD57的补偿调节正确后，CD4/CD69的显示就正常了。



案件是破了，但是大家有没有发现，在细胞群周围空白处，出现一些散在的点（如上图红色箭头处），这又是什么？真是一波刚平，一波又起。大家继续来猜猜。

＝＝2016年11月17日破案结果＝＝
上图中红色箭头所指的散在信号在调节正确补偿后，仍然存在，并且其它角落也都存在类似信号，我们平时只是知道不是正常的，会去排除掉它们，但来源，却不甚清楚，NIH中心的Pratip K. Chattopadhyay在PPT《Forensic Flow Cytometry》中指出，这些信号应该是〖非特异性结合细胞的荧光染料的高阶络合物〗，因为这些信号呈随机、点状染色，亮度强于特异性染色的大群细胞。这些信号可影响一些微量亚群识别的准确性。（见下图）



不过，这个名词“高阶络合物”（High-order complexes）以前确实没听说过，个人觉得应该类似于细胞粘连，染料之间也可能发生有序的粘连，然后非特异性粘到细胞上。精通此概念的FLOWER欢迎留言。

在解决方法上，Pratip K提出了如下解决办法：
1、染色时
将要染色的抗体组合搭配成cocktail（就是混合在一起）后，记得在微量离心机中全速旋转几分钟，然后再将这个上层的cocktail转移到新管子，能够有效避免染料的高阶络合物干扰染色。
这个方法是一种细节处理方法，确实容易忽略，平时大家如果碰到染料高阶络合物信号多的时候，可以试一试。

2、分析时
分析时画一个如下图这样的门，排除掉这些高阶络合物，然后再对这群细胞进行参数转换（Logicle或者Log转换）。分析时的这种设门方法在OMIP系列中经常可看到：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... ion=view&ctid=6

一成天

奇怪，难道是电压、补偿未合理调节？

xye_an

补偿问题

hbezyr

我遇到过同样的情况，是补偿的问题。

niwanmao

昨天的结果已公布，现在出了一个新的问题，大家继续猜

@xye_an  @一成天   @hbezyr

一成天

少量细胞贴于基线处，流体周围涡流干扰引起的杂信号？

hbezyr

偏差这么大，要么是气泡/不稳定的液流引起的，要么是细胞碎片或非单细胞颗粒。

niwanmao

昨天新发案件的结果已公布：）
@xye_an  @一成天  @hbezyr

苏格兰白草莓

这个活动挺好的，支持！

jiangmeng

niwanmao 发表于 2016-11-17 20:18
昨天新发案件的结果已公布：）
@xye_an  @一成天  @hbezyr

老师，请问是不是一个标本里面加入多种抗体，最好是把抗体先混合后，在一步加入标本？
需要有什么注意的操作吗？