关于Treg的问题

琪妙 · 发表于 2016-12-12 17:19:10

各位前辈大家好，我是一名流式小白，最近开始做实验，关于treg的问题一直有所困扰，查了好多资料，关于Treg的设门问题大家好像众说纷纭，有说CD4+CD25+的一群就代表Treg，有说CD4+CD25highCD127low的代表Treg，还有说CD4+CD25+CD127low的代表Treg，也有按照CD4+CD25+CD127-的设门代表Treg，由于经费问题，我并没有买同型对照，只是用空白对照进行参考设门的，请问各位前辈老师，对于Treg细胞的设门应该按照哪一种比较好呢?还有我是用人的外周血的全血测得treg，因为要对细胞内的一个AHR进行包内染色，后续有了固定和破膜的步骤，发现最后出来的结果并不是特别理想，阳性表达特别的少，几乎没有，不知道用外周血测treg一般跑多少细胞比较合适呢？抗凝剂管子我用的肝素钠抗凝的，不知道会不会对检测产生干扰。希望各位前辈不吝赐教。

niwanmao · 发表于 2016-12-12 20:52:57

一般临床上都是用CD4、CD25、CD127检测。
如果你有胞内染色，那么就直接用foxP3标记好了，不过foxP3是核内标记，需要用特殊的破核膜破膜剂。Treg占CD4＋T细胞比例还是算高的，大多在个位数，可以使CD4＋T细胞取到1万个。

破膜剂的选择比较重要，流式中文网的破膜剂会在月底前问世，可以破核膜，如果不急的话可以等一下，如果急的话可以直接买其它厂家的foxP3破膜剂。

琪妙 · 发表于 2016-12-13 17:00:47

谢谢倪老师的指导！我们买的抗体就是CD4，CD25，CD127，我看到老师圈门跟论文上的好像位置不太一样，我自己也下载了一个软件自己在分析，由于经费有限还是想着把这三个已有的抗体用好就行。我买的是联科生物的破膜固定液，在固定之后洗一次后加破膜液和包内抗体，不知道为什么总是然不出来，而且刚开始的散点图分群不明显，不知道是因为红细胞裂解不彻底还是因为细胞碎片太多了，导致后期分析特别困难。

琪妙 · 发表于 2016-12-13 17:01:39

请倪老师百忙之中能够指导@niwanmao

niwanmao · 发表于 2016-12-13 19:43:32

琪妙发表于 2016-12-13 17:00
谢谢倪老师的指导！我们买的抗体就是CD4，CD25，CD127，我看到老师圈门跟论文上的好像位置不太一样，我自己 ...

联科应该没有自己的，是代理的品牌吧？如果染不出来，需要通过各环节排除影响，例如破膜效果、抗体效价，我不知道你染的是什么胞内标记，也不知道你的图形怎么样，所以实在无法详细说什么。

琪妙 · 发表于 2016-12-17 21:23:55

倪老师您好，我还有问题需要向您请教。之前的试验我做的一直不好，这次换了方法，先把外周血中的单个核细胞分离出来，检测Treg细胞及胞内一个受体的表达。为了看清楚到底破膜剂和胞内染色效果我分了两组来做，一组只染了表面抗体CD4/CD25/CD127，一组加了固定剂和破膜剂及胞内染色AHR。能麻烦您帮我分析一下吗？
1.看第一群是不是淋巴细胞呀？只染表面抗体的那一组第一群分的不是很开，没有加了胞内的群分得开，因为加了胞内染得的那一群加了破膜剂还有裂解红细胞的作用，这样看我是不是因为PBMC提的不纯呢？但是要严格按照说明书来做我用外周血2ml感觉细胞数不太够。
2.为什么加了固定剂和破膜剂之后CD25的表达会下降呢？而且下降的特别多？
3.请问我这样设置的CD4+CD25+CD127low/-这一门位置对吗？如果不对的话我应该怎么放置？
4.TH17检测步骤中，我看大家有的把PBMC提取出来之后放到含有10%小牛血清的1640培养基中培养，我之前的1640里面没有加培养基，刺激5个小时之后感觉细胞死的有点多，不知道这个培养基中的血清是否是必要的？而且这个刺激培养的过程是否需要无菌操作？
请倪老师百忙之中能给予指导，谢谢您。@niwanmao

maomao · 发表于 2016-12-21 09:27:42

CD4+CD25highCD127low的为Treg

琪妙 · 发表于 2016-12-24 21:13:08

谢谢您的回复，我做实验有一个问题就是加了破膜剂之后表面CD25比不加破膜剂的要下调好多，差不多下调三倍，别说是CD25 high了，有就不错了。不知道您做实验用的也是这三个抗体做的Treg的吗？我要测一个胞内受体表达，不知道别的破膜剂会不会影响CD25的表达，您有好的固定破膜剂推荐吗？

niwanmao · 发表于 2016-12-25 15:49:58

琪妙发表于 2016-12-24 21:13
谢谢您的回复，我做实验有一个问题就是加了破膜剂之后表面CD25比不加破膜剂的要下调好多，差不多下调三倍， ...

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琪妙 · 发表于 2016-12-26 10:08:47

niwanmao 发表于 2016-12-25 15:49
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倪老师您好，我想问下如果我想购买试用装或者正式产品的话需要多少钱呢？

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