流式直方图不是正态的怎么调整

小兔子乖乖

倪老师及各位战友：我最近在做DC的表型鉴定（标本是小鼠骨髓细胞诱导分化的原代DC），结果从数值上来说是有意义的，但是流式直方图一直做不好，图形不是正态分布的，原来一直怀疑是染色的问题所以重复了很多次，但是还是没有好的结果，现在比较迷茫不知道是染色、标本处理的问题还是软件用的不对（flowjo 10）~请大家指导

附图：图左是别人文献里的图，图右是我自己做的图，使用的双参数转换。

这是别人文献里的图

这是我做出来的图

小憨

可能是你的样品细胞均一性不好吧，DC细胞不纯造成的，你的图是已经gate在DC细胞中了吗？

小兔子乖乖

小憨 发表于 2016-12-26 12:52
可能是你的样品细胞均一性不好吧，DC细胞不纯造成的，你的图是已经gate在DC细胞中了吗？ ...

恩，这已经是用磁珠提纯以后的细胞做的了

niwanmao

小兔子乖乖 发表于 2016-12-26 12:56
恩，这已经是用磁珠提纯以后的细胞做的了

建议看一下FSC/SSC散点图看看。

小憨

niwanmao 发表于 2016-12-26 19:37
建议看一下FSC/SSC散点图看看。

1. 虽然是磁珠分选，但是分选完成也可能有不高的时候，建议还是用流式测一下纯度。
2. Fc blocker封闭一下会不会有影响，倪老师觉得呢？

niwanmao

小憨 发表于 2016-12-27 17:25
1. 虽然是磁珠分选，但是分选完成也可能有不高的时候，建议还是用流式测一下纯度。
2. Fc blocker封闭一 ...

从这个直方图的荧光分布看，我个人总觉得：
1、你说的细胞纯度问题，可能把碎片也圈进去了，所以希望楼主能够看一下FSC/SSC的设门。
2、电压或补偿问题，例如第一个图蓝色直方图偏左，会不会因为电压太低或补偿过大，压线造成这个形态分布？

小兔子乖乖

niwanmao 发表于 2016-12-27 18:19
从这个直方图的荧光分布看，我个人总觉得：
1、你说的细胞纯度问题，可能把碎片也圈进去了，所以希望楼主 ...

倪老师，流式检测CD11c的纯度还是不错的，都在90%以上；细胞群体确实存在不少碎片， 我理解的是左下角那一坨不知道对不对，圈门的时候确实没有圈进去，但是主细胞群体也分俩群不知道为什么，这个图左边的细胞群体还算少，有的直接就均分成俩群了。。。下面是圈门的策略，您看看有啥问题~

圈门策略

niwanmao

小兔子乖乖 发表于 2016-12-28 08:19
倪老师，流式检测CD11c的纯度还是不错的，都在90%以上；细胞群体确实存在不少碎片， 我理解的是左下角那 ...

是否可将各个通道散点图都放上来看看？我担心CD80那种分布形式是补偿问题造成。

小兔子乖乖

MHC散点图

CD80散点图

CD88散点图

补偿值表1

补偿值2

倪老师，上图分别是CD11c门下不同指标的的散点图和补偿值，您看看有啥问题~辛苦啦！

小兔子乖乖

niwanmao 发表于 2016-12-28 16:26
是否可将各个通道散点图都放上来看看？我担心CD80那种分布形式是补偿问题造成。 ...

倪老师，详见上个回复呦~(∩_∩)