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〖你问我答〗同样的细胞,同样的荧光素,为什么补偿不一

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发表于 2017-1-13 16:52:44 | 显示全部楼层 |阅读模式

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论坛上,经常会有FLOWER会问,我的抗体一下子找不到很好的单阳性对照调节补偿,是不是可以借鉴相同荧光素其它抗体的补偿,或者使用师兄师姐用过的相同荧光素其它抗体补偿?

在回答之前,先来看看下面这两个图:
Fig1.jpg
图1、分别用CD57 PE和CD45RO PE-Texas Red两个单染管调节补偿,最后应用到CD57和CD45RO双染管,可见补偿调节得非常完美

Fig2.jpg
图2、同样是CD57和CD45RO双染管,但用来调节补偿的是CD3 PE-Texas Red和CD57 PE两个单染管,相当于只是将目标抗体CD45RO换成了CD3,其荧光素不变。结果CD57和CD45RO就变成上图那样,CD57减去CD45RO的补偿过度了。
这是为什么呢?



关键就在这个串联染料!

如果是非串联染料,例如FITC、PE、PerCP、APC、Alexa系列等等,你用CD3代替目标抗体进行补偿调节,没有问题。

但串联染料不同,例如前述的PE-Texas Red(也就是ECD),还有PerCP-cy5.5、PE-cy7、APC-cy7、APC-A700等等,不同批号之间会有所不同,甚至同一管抗体,经过较长时间保存或者受光照影响,都会导致补偿发生一定的改变,所以不同抗体即使结合了同一种荧光素,他们的补偿也不一定通用(当然,不是绝对不行,只是说存在这个风险)。

一句话:即使同一种串联染料,调节补偿时也要将不同抗体都当成不同的染料标记

—EOF—
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发表于 2019-2-12 15:04:58 | 显示全部楼层
倪老师我也有这种情况、还是在免疫细胞里、单染管都调的好好的、一到样品管里、补偿就不行了、还得每管再调一次、FITC、PE、PC5.5、PECF594、BV510、DAPI等等都有的
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