〖你问我答〗FMO对照设门该怎么设？

niwanmao

问

为了避免一些新手FLOWER不明白FMO对照，在此先将概念再重复一遍，FMO对照＝Fluorescence minus one，即荧光扣除对照，指的是多色实验时，要检测某个荧光通道的表达情况，由于荧光渗漏影响占主要，所以检测时先将该通道的抗体去掉，检测一下其它通道漏到此通道的背景荧光水平，进行正确排除，从而帮助设门。

那么问题来了，看下面这个FMO对照的图形，应该怎么设门才能使实验管（Fully Stained）获得正确的结果？是划在虚线这里吗？


应该按照虚线设门吗？


答
在不少FLOWER的观念中，分析表达率时门只有两种：一种是用于直方图的Marker，一种是十字门。

如果上面这幅图用了十字门分析，纵向的CD20没问题，但横向就硬生生截出了一小簇CD8＋＋CD20dim的细胞了，而这类细胞实际上是由于荧光分布误差造成的，而并非真实信号，所以应该使用下面这种不规则门圈出真正的CD20＋区域：


红线以上才是CD20阳性，排除掉了误差信号


这里可能有些FLOWER要继续问，但分析软件中并没有这种绘制门的工具。是的，这种曲线门的工具在分析软件只能通过多边形门（Polygon）绘制工具绘制，但在有些分析软件中，可以出现不规则的十字门（如下图），这种不规则十字门在分析多色流式荧光分布较大的时候特别有用：


上图所示的就是不规则十字门，这种门适用于阳性细胞群SD较大，而阴性群SD小的时候，不一定必须阴性和阳性群边界在一条直线上。
－－EOF－－

会开花的笔

学习了，但是这样画门会不会有主观因素，需要有经验的人才能识别该不该画曲线门

会开花的笔

倪老师，最近碰到一个问题，就是染了四色的抗体，对照管3个通道细胞分布都挺好，都在10^2一下，但就是PE通道，细胞总是压线，不知道是什么原因。如图所示。对照管每个通道所呈现出来的荧光强度由什么决定的呢？跟细胞的属性相关吗？因为不同的细胞群阴性画线不一样所以应该是跟细胞的属性相关的吧？？求解惑

niwanmao

会开花的笔 发表于 2017-1-20 22:19
学习了，但是这样画门会不会有主观因素，需要有经验的人才能识别该不该画曲线门 ...

这不是主观，而是经验。随便乱设，才叫主观。

niwanmao

会开花的笔 发表于 2017-1-20 22:33
倪老师，最近碰到一个问题，就是染了四色的抗体，对照管3个通道细胞分布都挺好，都在10^2一下，但就是PE通 ...

对照管的细胞和这管的细胞不是同类细胞？
细胞不同，尤其是FSC和SSC相差大的话，某些标记是可能会存在不同本底荧光。

会开花的笔

niwanmao 发表于 2017-1-20 22:37
对照管的细胞和这管的细胞不是同类细胞？
细胞不同，尤其是FSC和SSC相差大的话，某些标记是可能会存在不 ...

是两种亚型的细胞，大小是差异蛮多，如果全圈的话就没啥阳性了，分开圈阳性倒是挺高，但就存在一个问题，PE通道压线，这两群细胞分不开，这样一来上机的时候我是圈的其中一群，但就是这群细胞，PE通道就压线，并没有换到另一群

niwanmao

会开花的笔 发表于 2017-1-20 22:44
是两种亚型的细胞，大小是差异蛮多，如果全圈的话就没啥阳性了，分开圈阳性倒是挺高，但就存在一个问题， ...

全圈没有阳性，分开阳性？什么意思，不太可能啊。发现这样讨论离题了，开个新帖，放上图片讨论吧。