FSC-H和FSC-A在区分粘连细胞中的应用

steven

各位老师新年好

最近在应用FSC-H和FSC-A的图像来区分细胞粘连。结果得到了一个下面这样的图。

这个图中是P2以外的部分都是粘连细胞吗？好像样子很奇怪，和大家发布的图有很大区别，FSC-H好像达到一个最高值50左右之后就不升高了。是什么原因呢？
有几个概念还希望大家帮我明确一下。FSC-W代表了细胞通过的时间，那么FSC-H代表的是个什么值呢？谢谢大家。

niwanmao

steven 发表于 2017-2-7 08:24
谢谢老师回复，这样就明白了。
再多做几次看看。

结合你发的图片，写了篇科普，总结了一下。
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在流式数据获取时，有一个比较烦人的问题就是粘连信号，可能不少人都已经明白了，但为了让一些新手FLOWER也清楚此概念，在此说几句白话。所谓粘连信号，就是两个或多个细胞想去抢购双十一商品，结果在激光检测点一起卡在那里了，于是照射出来的身高（FSC-H）没怎么变，通过的时间延长了，那么用时间做横轴、FSC-H做纵轴计算出来的曲线下面积（FSC-A）就变大了，见下图，特别容易理解：


图1、上图为例，单个细胞通过的时间1us，曲线下面积10V/us。而粘连的一团细胞(两个或更多)通过时，时间延长到3us，曲线下面积变成了30V/us，明显变大，最后反映到FSC-A/FSC-H上，就明显看到粘连细胞偏离了A/H的线性范围。

通过上面这个图和图释，你应该了解了为什么用FSC-A/FSC-H排除粘连信号。但是，在BD的仪器上（Canto、Aria等系列），Diva软件中还有一个FSC-A缩放因子（FSC Area Scaling），你可知道？


图2、FSC Area Scaling设置

这个究竟是干什么用的，得先从FSC-A和FSC-H的关系说起。我们理想中的设想，A和H之间应该是相等的，也就是说在A和H的散点图上，两者之间应该是呈45度角分布， 如下图：

图3、理想王国里面，FSC-A和FSC-H应该呈45度角，呈1：1比例。

但实际却和理想不同，如下图：

图4、现实是残酷的，总是H比A小，于是夹角总是小于45度。

H抓狂地问：为什么我比A小？为什么？

H，你别急，我们边看图边聊：
一般说来，激光束大多只有8um大小，而细胞很多都是大于8um的，他们通过激光束的时候就象下图这样：

图5A、这样通过会形成什么后果呢？
  

图5B、如上图，在纵轴H、横轴Time的图上，H就会形成一个平台，就是说无法反映真正的细胞大小，但A不一样，因为细胞是整个通过的，所以A永远能反映细胞完整大小。所以就出现了现实中FSC-A>FSC-H的情形。

这下H默然了，哀怨地问：那咋办

好办，就是通过前面所说的FSC Area Scaling，将该因子调小，就可以使两者接近1：1，在两者散点图上基本位于45度角上。


上图是FSC Area Scaling设置之前的样子


上图是FSC Area Scaling设置之后的样子，差别明显吧

正是因为H和A存在这样的关系，所以需要强调一句的是：

Diva软件中（其它软件应该也差不多）的Threshold设置是FSC时，指的是设置为FSC-H，而不是FSC-A。

这下H总算争回一口气了。

niwanmao

1、你用的是什么机器？是不是Scaling因子设置的问题？
2、W和H意义差不多，某些情况下可互相替换。

steven

niwanmao 发表于 2017-2-1 13:27
1、你用的是什么机器？是不是Scaling因子设置的问题？
2、W和H意义差不多，都可以互相替换。 ...

用的是BD ARIA III。老师你是说parameter的激光强度调节的太小了吗？
上边这个图讲解的原理中，w的原理还挺容易懂的，H不明白为啥有高有低。

要是按照这个图的原理来讲，H是与和遮挡激光的面积有关吗？如果老师能详细讲一下最好了，或者有相关的文献劳烦告知。

niwanmao

steven 发表于 2017-2-1 17:33
用的是BD ARIA III。老师你是说parameter的激光强度调节的太小了吗？
上边这个图讲解的原理中，w的原理还 ...

你的问题解决方法：
1、增加FSC电压。
2、如下图，在Laser窗口中，将FSC Area Scaling因子改得小一些。


H为什么不一样高，这个原理上可能还是和细胞大小有关，细胞小通过的时间短，不仅导致W和A小，而且产生的脉冲高度H也会矮。

steven

niwanmao 发表于 2017-2-1 22:19
你的问题解决方法：
1、增加FSC电压。
2、如下图，在Laser窗口中，将FSC Area Scaling因子改得小一些。

谢谢老师详细的讲解。我明天就试验一下。因为要分选细胞很小，用的2.0的滤镜，还要把FSC和SSC调的特别低所有细胞才能在一张图上显示全，所以调高FSC有点难度，我试试第二种办法吧，再次感谢。

博古书生

steven 发表于 2017-02-02 08:15:45

                               
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谢谢老师详细的讲解。我明天就试验一下。因为要分选细胞很小，用的2.0的滤镜，还要把FSC和SSC调的特别低

你可以试下用SSC-A和SSC-H看看会不会好些！

steven

博古书生 发表于 2017-2-3 12:19
你可以试下用SSC-A和SSC-H看看会不会好些！

谢谢 我试一下

steven

niwanmao 发表于 2017-2-1 22:19
你的问题解决方法：
1、增加FSC电压。
2、如下图，在Laser窗口中，将FSC Area Scaling因子改得小一些。

谢谢老师指导，更改FSC Area Scaling的数值，FSC-A与FSC-H的图像比原来改善了很多。
但出现了一个新的问题，按照FSCA-H的图像来说，红色部分应该是粘连部分，在FSC-SSC图像上看也确实细胞体积很大，但是选取红色部分细胞分选后镜检发现细胞并没有很多粘连，而只是单纯的比绿色区域细胞尺寸大。这是什么原因呢？难道红色部分根本不是粘连的细胞？
另外有老师建议用SSCA-H试一下，得到的图像如上所示（红色区域和蓝色区域是同一区域），看起来似乎没有什么粘连现象吧。
请老师帮忙解答谢谢。

niwanmao

steven 发表于 2017-2-6 10:47
谢谢老师指导，更改FSC Area Scaling的数值，FSC-A与FSC-H的图像比原来改善了很多。
但出现了一个新的问 ...

FSC-A/FSC-H基本可用，分选后没有粘连也是正常的，因为这种信号可能意味着它们通过激光检测点时，可能因为细胞比较大，难逐一通过，而造成两个细胞同时堵在口子上，形成粘连信号，并不一定就是两个细胞紧紧粘在一起。

准确地说，是用FSC-A/FSC-H排除粘连信号，并非紧紧粘连在一起不分离的细胞。