宫颈脱落细胞的流式免疫分型问题，求教高人

柠檬果秋秋

目前课题涉及到通过流式对宫颈脱落细胞进行免疫分析，做的很不顺利，特此想请教倪老师。
我的实验步骤是：1.样本制成单细胞悬液，装入15ml离心管。
                          2.细胞计数。（>10^6可上机）
                          3.1200r/m 离心10min，几乎无细胞沉淀，后加大转速，3000r/m 离心10min，弃上清。
                          4.加pbs 2ml，3000r/m 离心10min，洗两遍。分成两管，待测管和测定管，上清尽量弃干。
                          5.分别加10ul 荧光单抗和同型对照，震荡混匀，4度冰箱反应30min。
                          6.pbs 洗两遍，转速3000r/m 离心5min。
                          7，过尼龙筛，上机。
可是做出来结果  a. 测定管和同型对照管阳性数差不多，测定管阳性36，对照管24，我取的绒毛样本，理论上应该测定管阳性率100%左右。
                        b. 实验过程中随着洗涤细胞越来越少，不知道是否细胞转速过大和塑料离心管沾细胞的问题
                        c. 不知老师有否涉及到宫颈脱落细胞，对于含有粘液的样本（需要粘液中的细胞）上机前如何处理？
                       d .  还有就是固定和破膜的问题，靶标抗原表达在细胞膜上，没有查到具体表达于细胞膜表面、胞膜中间或是胞膜内层，不知是否需要破膜？又是否需要固定？
         实验新手，刚接触流式，望大家和倪老师多多指教

niwanmao

a、用同型对照设门不太合适，因为首先同型对照是否选择正确很难确认，其次同型对照的非特异性结合问题。推荐用阴性表达该抗原的细胞做设门对照。如果真要用同型对照，建议Fc Block或AB型血清封闭后再测。

b、洗涤次数越多，肯定就会丢失越多，这是正常现象，跟倾倒液体丢失、离心时细胞死亡都有关。

c、对含粘液的细胞我倒经验也不足，从理论上讲这些粘液含糖蛋白，是否可用蛋白酶预处理？

c、建议还是先查清楚靶抗原表达在什么部位再做。如果实在查不到，就固定后再破膜，但大多数破膜剂都对形态影响较大，可考虑试试咱们流式中文网的新型破膜剂。

柠檬果秋秋

niwanmao 发表于 2017-2-15 08:15
a、用同型对照设门不太合适，因为首先同型对照是否选择正确很难确认，其次同型对照的非特异性结合问题。推 ...

谢谢倪老师的解答！还有一个小问题想要请教您，加荧光抗体的时候样本是尽量弃去上清只留细胞样本还是留少量上清液？

niwanmao

柠檬果秋秋 发表于 2017-2-15 09:42
谢谢倪老师的解答！还有一个小问题想要请教您，加荧光抗体的时候样本是尽量弃去上清只留细胞样本还是留少 ...

刚刚在另一个帖子回答了：
尽量去干净，但不可能完全去光的，就是倒过来，姿势不变，在纸巾上轻轻碰一下，将管口的液体吸干即可。

柠檬果秋秋

niwanmao 发表于 2017-2-15 14:01
刚刚在另一个帖子回答了：
尽量去干净，但不可能完全去光的，就是倒过来，姿势不变，在纸巾上轻轻碰一下 ...

多谢倪老师！

phstudy

我朋友也是在做这方面实验
目前遇到的问题是：
宫颈粘液如何处理？资料上说用酸，但又担心影响细胞表面marker。
倪老师、还有楼主，能给点建议不？

301red

宫颈粘液用乙酸  乙酰半胱氨酸等都试过了，效果都不好，同求能水解宫颈粘液释放细胞的方法。

niwanmao

301red 发表于 2018-5-18 17:14
宫颈粘液用乙酸  乙酰半胱氨酸等都试过了，效果都不好，同求能水解宫颈粘液释放细胞的方法。 ...

可先考虑用1 mM dithiothreitol（DTT，pH值调到7.2）处理5分钟，然后加入大体积 PBS洗涤离心试试。（参考文献：Flow cytometric analysis of intestinal intraepithelial lymphocytes in a model of immunodeficiency in Wistar rats）

如果5分钟去不掉，可能需要增加孵育时间或者DTT浓度，但是增加时间和浓度，可能会造成CD11b、CD18等荧光强度降低或百分比变化，但由于大家都变，所以样本之间的对比不影响（参考文献：痰液处理 http://erj.ersjournals.com/content/erj/16/2/324.full.pdf）。

phstudy

宫颈脱落细胞，有什么临床项目可以开展的吗？ 最和能够提供一定的辅助诊断信息

niwanmao

phstudy 发表于 2018-8-14 14:29
宫颈脱落细胞，有什么临床项目可以开展的吗？ 最和能够提供一定的辅助诊断信息 ...

目前还是病理的液基活检的天下。