小鼠脾脏用70um筛子处理完后的现象

saureus

小鼠脾脏分离出来，除去粘连的白色脂肪，而后放到70um的cell restrainer中，加培养基研磨。
3000rpm离心后将细胞沉淀重悬的时候，总是有丝丝落落的东西，请问老师是脂肪还是细胞死了（！）？

niwanmao

saureus 发表于 2017-2-17 20:32
谢谢倪老师的指点！3000rpm是有点大，1100g左右。
我用了2000rpm，但是上清不澄清，有白色的东西，很像细 ...

白色一层是脂肪吧。
我们平时分离一些血脂高的病人血也遇到类似你这种情况，尽管物种不同，但情况有点类似，建议还是用500g离心，太高细胞容易死亡，尤其是这些组织细胞。
不会倒掉的。

流式中文网今年准备出一个神器，让你们不用离心就能去掉上清

niwanmao

3000转是不是转速太高了？
另外，推荐用一下网站的好东西”魔滤“：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5570-1-1.html ，搭配细胞保存液（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html），我们这边的研究生刚刚前几天用来磨小鼠脾脏，效果非常好。

saureus

niwanmao 发表于 2017-2-17 19:36
3000转是不是转速太高了？
另外，推荐用一下网站的好东西”魔滤“：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-557 ...

谢谢倪老师的指点！3000rpm是有点大，1100g左右。
我用了2000rpm，但是上清不澄清，有白色的东西，很像细胞。后来加速，一直加到3000rpm，上面出现白色的一层，像是细胞，您的意思是说细胞死了吗？
我看标准规程上都是400g左右，更是离不下来，那么上清中的“细胞”就都倒掉不要了吗？那是细胞吗？
魔滤是好东西，我但时候试试。

saureus

niwanmao 发表于 2017-2-17 20:48
白色一层是脂肪吧。
我们平时分离一些血脂高的病人血也遇到类似你这种情况，尽管物种不同，但情况有点类 ...

非常均匀的白色物质，高速离心后上面有一层白色的东西，您说的病人血清的情况也是这样吗？
期待倪老师的神器！

niwanmao

saureus 发表于 2017-2-17 21:53
非常均匀的白色物质，高速离心后上面有一层白色的东西，您说的病人血清的情况也是这样吗？
期待倪老师的 ...

病人的那层是偏米黄色，用吸管碰一下会明显粘管的。

小憨

1. 白色的东西应该不是细胞，可能是组织碎片或者胶原纤维等细胞外基质。
2. 分离脾细胞可以用40 μm的细胞筛。

saureus

小憨 发表于 2017-2-21 20:44
1. 白色的东西应该不是细胞，可能是组织碎片或者胶原纤维等细胞外基质。
2. 分离脾细胞可以用40 μm的细胞 ...

谢谢您的回复！看来我的离心力过大了！

小憨

saureus 发表于 2017-2-22 13:54
谢谢您的回复！看来我的离心力过大了！

离心力这个事情其实还挺妙的，从100 g到1000 g好像我都见过，我自己尝试过1000 g×3 min，对于人和小鼠的淋巴细胞一点影响都没有；500 g×5 min也挺好，300 g×8~10 min也不错。但是如果我是分离细胞用于后续培养的话，离心力还是低一点，300 g×8 min是我的常用配置；如果只是用于流式分析，并不需要后续培养的话我还是喜欢用500~600 g×5 min。不过以上条件仅仅限于个头比较小的细胞，比如淋巴细胞，对于大细胞就要消息不要离破了才好。