找回密码
 加入流式中文网

QQ登录

只需一步,快速开始

查看: 5853|回复: 3

多聚甲醛固定的那些事儿

  [复制链接]
发表于 2017-2-24 18:27:52 | 显示全部楼层 |阅读模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?加入流式中文网

×

昨天,流式中文网FLOWER@柠檬果秋秋 提了个问题:
刚看到一篇文章审稿人让我不要用多聚甲醛固定流式样本!
可是查了很多资料都说用多聚甲醛固定,很迷惑,特来请教老师


多聚甲醛固定,确实是老生长谈,很多研究生在做实验时,可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定,有些可能是为了长时间保存样本,希望集中起来染色,有些可能是染色后排不上队,想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。

那么,面对刚才@柠檬果秋秋 所提到的网上截然相反的两个观点,应该如何看待?

预固定问题
做科研或临床时,可能很多FLOWER习惯性都会用4%多聚甲醛预先固定标本,可能出于三个目的:
(1)为了灭活标本里面可能存在的微生物(细菌、病毒等),起到安全保障作用。
(2)希望标本能够较长时间存放
(3)做胞内染色前的准备。
但是,可能很多人忽视了一点,就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本,细胞表面有些位点在固定后构象发生改变,使得抗体无法结合产生假阴性,也可能由于固定作用,导致其它位点产生非特异性结合(假阳性)。

因此,知道哪些抗体染色前不能预固定,十分重要。幸好,我们自己不用做验证,在Biolegend公司网站上(http://www.biolegend.com/fixation),贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试,下面两张表,一张是人类抗原,一张是小鼠抗原,可以看的出来,大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体,所以,大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。

表1、4%多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响(人类),打勾的为允许预固定,打叉的表示预固定影响很大
Fixation-Human-min.jpg

表2、4%多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响(小鼠),打勾的为允许预固定,打叉的表示预固定影响很大
Fixation_mouse-min.jpg


染色后固定问题
染色后的固定,就与抗原构象关系不大了,更多的是荧光素。以前4色以内的时候,用的荧光素都是非串联的,因此大多数影响不大,但随着各种新型串联染料的出现,多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上,当你去搜索串联染色标记(如PE-cy7、APC-cy7等)的抗体时,会发现一些比较详细的描述里面会注明(以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例):
Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.

意思就是用多聚甲醛固定过的样本,必须在4小时内检测,否则容易导致串联染料降解,若要长时间保存,还是需要洗涤后,转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是,做GFP荧光检测的同学,也需要注意一下,多聚甲醛固定也会影响GFP,New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后,并非使GFP荧光淬灭,而是使GFP蛋白构象发生改变,无法产生荧光。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光,或剩余的未被改变构象的GFP发出的。

解决方案
游客,本帖隐藏的内容需要积分高于 55 才可浏览,您当前积分为 0

引用资料
1、https://www.researchgate.net/pos ... ce_after_fixation10
2、http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5164-1-1.html
3、http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5732-1-1.html
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2021-11-4 11:00:16 | 显示全部楼层
用多聚甲醛固定细胞后做流式,同时能够起到灭活病毒作用的,有SCI参考文献么?最好是新冠的
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2023-2-28 23:59:40 | 显示全部楼层
老师,实体肿瘤组织福尔马林固定以后还能用于提取流式的单细胞悬液吗?染色会不会受影响
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2023-3-1 09:12:05 | 显示全部楼层
animita 发表于 2023-2-28 23:59
老师,实体肿瘤组织福尔马林固定以后还能用于提取流式的单细胞悬液吗?染色会不会受影响 ...

福尔马林固定的浓度过高,对很多抗原表位都有改变,所以只能用病理专用的单抗检测,没法在流式上检测。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2|浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2024-3-29 00:06

Powered by Discuz! X3.5

© 2001-2024 Discuz! Team.

快速回复 返回顶部 返回列表