多聚甲醛固定的那些事儿

niwanmao

昨天，流式中文网FLOWER@柠檬果秋秋 提了个问题：

刚看到一篇文章审稿人让我不要用多聚甲醛固定流式样本！
可是查了很多资料都说用多聚甲醛固定，很迷惑，特来请教老师

多聚甲醛固定，确实是老生长谈，很多研究生在做实验时，可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定，有些可能是为了长时间保存样本，希望集中起来染色，有些可能是染色后排不上队，想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。

那么，面对刚才@柠檬果秋秋 所提到的网上截然相反的两个观点，应该如何看待？

预固定问题
做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的：
（1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。
（2）希望标本能够较长时间存放
（3）做胞内染色前的准备。
但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。

因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站上（http://www.biolegend.com/fixation），贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。

表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大


表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大



染色后固定问题
染色后的固定，就与抗原构象关系不大了，更多的是荧光素。以前4色以内的时候，用的荧光素都是非串联的，因此大多数影响不大，但随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上，当你去搜索串联染色标记（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗体时，会发现一些比较详细的描述里面会注明（以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例）：

Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.

意思就是用多聚甲醛固定过的样本，必须在4小时内检测，否则容易导致串联染料降解，若要长时间保存，还是需要洗涤后，转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是，做GFP荧光检测的同学，也需要注意一下，多聚甲醛固定也会影响GFP，New York Medical College的Paul A Lucas认为是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP荧光淬灭，而是使GFP蛋白构象发生改变，无法产生荧光。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或剩余的未被改变构象的GFP发出的。

解决方案

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引用资料
1、https://www.researchgate.net/pos ... ce_after_fixation10
2、http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5164-1-1.html
3、http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5732-1-1.html

lxk47640

用多聚甲醛固定细胞后做流式，同时能够起到灭活病毒作用的，有SCI参考文献么？最好是新冠的

animita

老师，实体肿瘤组织福尔马林固定以后还能用于提取流式的单细胞悬液吗？染色会不会受影响

niwanmao

animita 发表于 2023-2-28 23:59
老师，实体肿瘤组织福尔马林固定以后还能用于提取流式的单细胞悬液吗？染色会不会受影响 ...

福尔马林固定的浓度过高，对很多抗原表位都有改变，所以只能用病理专用的单抗检测，没法在流式上检测。