使用先固定破膜再染CD4效果差 望指教

小青菜

买不到牛的CD3，只能使用CD4，使用25 ng/ml PMA plus 1ug/m lionomycin 进行刺激，然后先进行固定破膜处理再进行染CD4的，结果未刺激组能分出CD4，而刺激组基本无法染上CD4  如图所示左边是未刺激 右边是离子霉素加PMA共刺激的结果图， 望解答

niwanmao

是不是细胞死了？
FSC/SSC散点图对比对比看

小青菜

niwanmao 发表于 2017-2-26 16:58
是不是细胞死了？
FSC/SSC散点图对比对比看

是死的有点多，但也不会差别这么大吧，我是固定破膜后 将CD4和细胞因子抗体 混在一起染色的 会有影响么

niwanmao

小青菜 发表于 2017-2-26 17:26
是死的有点多，但也不会差别这么大吧，我是固定破膜后 将CD4和细胞因子抗体 混在一起染色的 会有影响么

...

死细胞多当然差别大的。
细胞因子未刺激管染色如何？

小青菜

niwanmao 发表于 2017-2-26 18:05
死细胞多当然差别大的。
细胞因子未刺激管染色如何？

不好意思 我不太明白什么叫细胞因子未刺激？  我设的是 未用PMA+离子霉素刺激的组 和使用PMA+离子霉素刺激的组   未刺激组染色CD4蛮正常的

niwanmao

小青菜 发表于 2017-2-27 16:41
不好意思 我不太明白什么叫细胞因子未刺激？  我设的是 未用PMA+离子霉素刺激的组 和使用PMA+离子霉素刺 ...

你用PMA＋离子霉素刺激后肯定是希望检测胞内细胞因子，我的意思是两组之间的胞内因子表达情况是否有差别？

小青菜

niwanmao 发表于 2017-2-27 19:19
你用PMA＋离子霉素刺激后肯定是希望检测胞内细胞因子，我的意思是两组之间的胞内因子表达情况是否有差别 ...

有差别 而且蛮大的 不过细胞数过少会不会不具有代表性 我今天又做了一次 发现PMA刺激组的细胞增殖 明显小于其他刺激组（PWM ConA） 是我加入的量不对么？

niwanmao

小青菜 发表于 2017-2-28 17:00
有差别 而且蛮大的 不过细胞数过少会不会不具有代表性 我今天又做了一次 发现PMA刺激组的细胞增殖 明显小 ...

看不到图，无法下定论。

小灰

一般流式操作顺序是：先标膜蛋白、再固定破膜、在标膜内蛋白。如果先固定破膜会造成膜蛋白丢失，含量低的情况下会出现标记不出的情况。

whyxa

PMA刺激过的CD4T cell会造成CD4内翻，但我还没有用过破膜后染表面的，如果你刺激培养时间不超过4-12h的话，我建议你先染CD4，在刺激。 我遇到过两次破膜后染色，一次是漏染了CD8，一次是漏染了CD3，跑flow 的时候才发现，在复染，均未染上，我的标本是猴子的外周血，不知道为什么