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悬赏1流星已解决
请教各位老师，就是测胞内因子总是测不出来，不知道是刺激不够还是破膜出了问题这里安全说明书的操作.不知道有没有错：
1. 1：1全血与1640混匀（0.5ml与0.5ml）
2.加入BD Pharmingen™ Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug™ 2ul(但是放-80度，每次都要反复冻融，但是说明书又这么说的。。不知道各位有没有高见啊)
3.孵箱中6个小时
以下操作未在无菌台中进行
4.取200ul全血与1640混匀血与流式细胞管中
5.裂解红细胞，洗1次（洗了后我倒了过后在瓶口用棉签把水吸干了，流回去的估计10-20ul最后）
6.加入stain buffer 50ul，加入CD3-FITC,CD4-APC（这里因为以前表面染色的时候用的2ul也做了一些结果，这几次也没有用说明书推荐计量的5ul，因为说明书用100ulbuffer+5ul抗体，不知道影响大不），避光孵育15分钟，然后洗一次，倒干净（倒的时候也是吸干净了，每一次倒液体都尽量倒干净了）
7.加固定破膜剂500ul，充分混匀（加进去的时候我来回吹打了，然后vertex了），避光20分钟
8.离心，倒掉
9.加入破膜buffer 2ml，避光10分钟，然后离心，倒掉
10.加入IL-17A-percy5和IFN-γ-pecy7 各2ul（说明书说的5ul），避光孵育30分钟
11.buffer洗一次，上机。
不知道各位看看标本处理有没有问题啊~万谢
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最佳答案
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说明书是说要长期保存的话，需保存在-80度，短期就4度保存即可，反复冻融没必要。
至于刺激效果，很难判断，我的建议是你再提取单个核细胞培养刺激试试，如果还是标不出来，需要依次排除破膜剂、抗体等原因。步骤问题不大。
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发表于 2017-3-1 23:33:23
发表于 2017-3-1 23:33:24
