五大技术，让流式细胞术更快

niwanmao

GEN网站昨天的新闻综述，里面涉及到不少新技术以及研究亮点，值得你细读。
技术变革通常由人们的需求驱动。 流式细胞术也是如此。
仪器和处理技术的设计正在不断发展，以满足研究人员和药物开发者的需求， 目的是可以进行更快、更准确的实验。
仪器制造商和科学家去年在利兹进行了流式聚会，讨论如何引进新的免疫生物标志物、创新染料和方案设计以及改进检测罕见事件的技术。
与流式细胞术相关的一个创新市场是免疫治疗药物的全球药物研究，例如治疗性抗体。 开发这些药物的挑战之一是管理机构想要理解抗体的确切结构。

改善靶向标记
标记用于流式细胞术的治疗性抗体可改变其结构并损害其功能。 Thermo Fisher Scientific现在提供了一种连接到抗体上已知位点的标记技术（SiteClick™抗体标记系统），该标记附着于Fc结构域，避免抗体的结合位点并保持其功能。

Thermo Fisher Scientific蛋白质和细胞生物学的工作科学家Chris Langsdorf博士说：“我们过去提供了类似的东西。现在只是使染料和标记种类更多。“

在他的演讲中，Langsdorf博士讨论了治疗性抗体Rituxan（利妥昔单抗）和Herceptin（曲妥珠单抗）的两个著名的治疗性药物模型。在接受GEN的采访时，他解释说，SiteClick标记也与掺入非天然氨基酸的抗体兼容，标记可以附着到抗体中的任意结合位点。

药物开发中的另一个不断增长的创新是抗体 - 药物偶联物（ADC）。这些使用单克隆抗体靶向癌细胞，并且它们可以递送有效的细胞毒性药物的有效载荷。 Thermo Fisher Scientific已经开发了一系列红色和绿色的荧光（pHrodo®）染料，只有当它们被带入细胞内的溶酶体或内涵体－酸性区间时才会发出荧光。

Langsdorf博士指出：“pH敏感染料是第二代构建体。 “这里的新颖之处在于它们非常适合用于抗体标记。”

添加更多参数

观察大量参数的流式细胞术实验变得越来越普遍。一个驱动因素是需要同时观察多个生物标志物的需求。

都柏林Trinity College流式细胞术主管Barry Moran博士的研究重点是罕见但严重的皮肤疾病——化脓性汗腺炎。以前的研究发现难以识别参与疾病的免疫细胞和表达的炎症信号，因此Moran医生转向流式细胞术。

“样本量有限，样本中只有少量免疫细胞，”他指出。 “因此，收集最多数据的最好方法是多参数流式细胞术，因此我们同时使用大量的荧光标记抗体检测。“

Moran博士在他的演讲中使用了15个荧光标记物进行研究。他想要鉴定各种细胞群体及其特征。他强调，在他的工作中，仅仅观察一种或两种细胞因子是不够的，最好是同时观察每个细胞表达的各类促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡。

“高维度免疫表型研究绝对是一个新兴的研究领域，”剑桥大学医学系博士后研究员Lorinda Turner博士说。根据Turner博士，这一发展在很大程度上归功于可用于标记感兴趣的颗粒的荧光染料缀合物的数量增长，以及引入具有更多激光和过滤器的流式细胞仪用于检测。

“这些多参数机器在世界各地越来越普遍，导致这些高维度免疫表型研究的指数增长，”特纳博士坚持。

NIHR Cambridge BRC细胞表型中心是Turner博士项目的合作者，最近收购了BD Biosciences Fortessa X30（FACSymphony）。这是一个高端机器，能够检测28个不同通道中的荧光信号，可选择升级到50个通道。

Turner博士的工作是首先使用复杂的多参数流式细胞术来研究精神分裂症中的免疫系统。她说，免疫系统可能在精神分裂症和其他精神健康疾病的发展或病理学中发挥作用的想法在过去五年左右已成为一个强烈的研究领域。

她的工作旨在确定各种精神疾病（包括精神分裂症）中免疫细胞群体的变化。通过鉴定这些免疫细胞的比例或活化的改变，它们可以被开发为生物标志物或治疗靶标。

Turner博士指出，她的研究的主要挑战是对高维流式细胞术数据的意义。除了记录细胞计数，研究者必须测量多种细胞因子，进行基因表达分析和分析复杂的临床数据。

为了解决她工作中固有的数据挑战，Turner博士使用偏最小二乘回归的多元统计技术来降低数据的维数，以鉴定预测疾病的免疫细胞表型的几个关键组合。

降低荧光渗漏

多参数流式细胞术的挑战之一是荧光渗漏，这是由于荧光染料的发射光谱重叠，导致某一染料通道中，会检测到附近另一染料的发射光，因此必须进行补偿调节，避免相邻通道荧光的干扰。

Moran博士的研究中，一些细胞常常共表达几个感兴趣的生物标志物，这几个标志物组合检测，就存在较高的荧光渗漏风险。因此，优化荧光染料组以减少溢出是研究的重要部分。

一种解决方案是改进荧光染料，使得它们在被激光激发时不太可能引起溢出。 Thermo Fisher Scientific发布了新的Super Bright紫光染料，根据Langsdorf博士介绍，此类染料具有窄的发射光谱，以降低来自不同荧光染料的重叠信号的风险。

流式中文网注：这类染料不知道是否有FLOWER用过，是否可以介绍一下？

加快分析

另一个趋势是加速流式细胞术以改善罕见事件分析。 Propel实验室研发总监Dan Fox致力于开发新的Bio-Rad ZE5细胞分析仪。他与10个客户的小组合作，根据他们的规格构建细胞仪。

该款流式细胞仪一个特色是集成的板式上样，声称在不到15分钟内处理样品之间的小于0.5％残留的96孔板。根据Fox，这是根据客户反馈而开发的。客户经常抱怨手动执行任务，如维护、清洁和将上样机连接到流式细胞仪是太费力了。

“他们有60到80根管，有多种颜色和多个病人样本，”Fox介绍道， “他们想要快速获取，而不是一次一个管。”

新的上样机具有自动清洗站，就在样本针后面，它可以注入一系列清洗液体和气泡，清洗样品之间的内部管路。据Fox说，这节省了来自常规细胞仪在不同样品上样之间洗涤的时间。

Fox解释说，快速上样机的一个好处是，客户可以处理更多的细胞，更快地获取信息，并生成更好的统计数据。该系统还具有定制激光器和10psi的高流体压力，允许其每秒处理高达100,000个事件。这是为寻找稀有事件的客户开发的，例如循环肿瘤细胞。

扩大检测范围

科学家正在逐渐增加可以通过流式细胞术检测的分子的范围。检测mRNA，结合计数CD4细胞，在监测HIV患者的病毒载量中具有应用。然而，mRNA量非常少，并且信号扩增技术（例如PCR）会破坏细胞，使得它们不能用于流式细胞术。

“当你已经达到93°C并再次降低到50°C，20或30次，将细胞通过流式细胞仪是不现实的，”Roswell Park Cancer Institute肿瘤学教授兼流式和图像流式部门主任保罗·华莱士博士如是说。

他已经提炼了在较低温度下工作的mRNA的扩增技术，并且对细胞更温和。分支DNA技术是一种多步骤过程，其可以产生通过细胞仪测量的荧光信号的理论上的8,000至16,000倍扩增。

“一个细胞可以产生大量的mRNA拷贝或几个拷贝，”华莱士博士解释说。 “我们能够用流式细胞仪检测到少至5个拷贝。

分支DNA技术使用“Z探针”，每个含有20个互补DNA碱基，以结合靶mRNA序列。然后，前置放大器与Z-探针结合，放大分子与前置放大器上的多个位点结合，荧光标记与每个放大器上的多个位点结合。该过程中的每个步骤将目标信号放大约20倍。

该技术还可用于研究细胞内蛋白质表达的动力学。例如，它可以监测细胞开始产生mRNA的时间和其作为蛋白质的表达之间的时间。根据华莱士博士的说法，它也是一种标准抗体方法来替代细胞标记：“如果我们感兴趣的抗原，但我们没有抗体，我们可以使用分支DNA方法作为替代方法以确定基因是否由细胞表达。

如需查看英文原文，请参考文献源：
GEN：http://www.genengnews.com/gen-ar ... flow-cytometry/5988