NK细胞的分离鉴定

leeshamimi

我想请问，我用全血直接标记NK细胞，在50μL全血加入CD3-FITC、CD16-PEcy7、CD56-PE染色，然后再马上加红细胞红细胞裂解，4℃孵育20min，圈门淋巴细胞，CD16+为16.6%，但是CD56+只有2.4%，我想问问我的CD56+是没有染上色吗？用PBMC进行CD3-FITC、CD16-PEcy7、CD56-PE染色，圈门是PBMC中的淋巴细胞，CD16+为9.3%，CD56为8.0.%
用磁珠分析NK细胞，进行CD3-FITC、CD16-PEcy7、CD56-PE染色，CD16+为97.1%，CD56+为85.3%
我查找资料说NK细胞占PBMC中淋巴细胞的15%，那到底是CD3-CD16+占这15%，还是CD3-CD16+CD56+占这15%，还是CD3-CD56+占这15%?就是说NK细胞到底怎么分析？
还有我用磁珠分离的NK细胞答得到要求吗？

磁珠分离NK细胞的检测

niwanmao

首先要说的，你这个CD56抗体有问题，荧光强度不达标。

CD3－CD56＋和CD16＋CD56＋，在正常情况下是十分接近的，可以互相替换，只有在少数情况下CD56＋CD16－细胞比例增高时，才会相差较大。
用磁珠分选出的NK细胞纯度还可以吧，但是设门不行，需要用矩形门把CD16＋CD－的细胞圈起来。

oAria

站友你好，最近我刚开始学做NK和流式。
对你的实验，我有一个问题。全血中红细胞很多，和白细胞相差10^3倍，PBMC只是白细胞的一部分，NK的比例也不高。用全血样本直接染色是不是会影响染色效果？

niwanmao

oAria 发表于 2017-3-23 19:47
站友你好，最近我刚开始学做NK和流式。
对你的实验，我有一个问题。全血中红细胞很多，和白细胞相差10^3倍 ...

不会影响。因为红细胞不会结合这些抗体。

oAria

niwanmao 发表于 2017-3-23 21:21
不会影响。因为红细胞不会结合这些抗体。

谢谢管理员的回答！

leeshamimi

谢谢管理员的回答。
我想请问下，我的磁珠分离的NK和PBMC上的NK荧光是染上了吧？那就是我的全血的CD56+没有染上？是我全血染色方法出现问题吗？其中PBMC中CD56+只有8%左右，没有一些文献上说的15%左右。
我的全血染色方法是，在50μL全血加入CD3-FITC、CD16-PEcy7、CD56-PE染色，然后再马上加红细胞裂解液，4℃孵育20min，圈门淋巴细胞，请帮我看看是否有问题。
还有说磁珠分选NK细胞设门不行，是需要把CD16+CD56-圈出来吗？这样的目的是什么？

特勒兮兮

leeshamimi 发表于 2017-3-24 09:34
谢谢管理员的回答。
我想请问下，我的磁珠分离的NK和PBMC上的NK荧光是染上了吧？那就是我的全血的CD56+没有 ...

全血染色之后要孵育一段时间然后再加溶血素，溶血素溶解的时间不要太长，10到15分钟应该是可以的

774055480

leeshamimi 发表于 2017-3-24 09:34
谢谢管理员的回答。
我想请问下，我的磁珠分离的NK和PBMC上的NK荧光是染上了吧？那就是我的全血的CD56+没有 ...

我觉得你全血加上抗体之后马上加红细胞裂解液不太好，BD公司的一般做法是先染好抗体，之后再用比较温和的红细胞裂解液处理一下。

个人觉得你全血样本中CD56抗体可能受到某种影响，没有染好

特勒兮兮

leeshamimi 发表于 2017-3-24 09:34
谢谢管理员的回答。
我想请问下，我的磁珠分离的NK和PBMC上的NK荧光是染上了吧？那就是我的全血的CD56+没有 ...

按道理来说PBMC和全血测出来的NK比例是差不多的，你全血NK几乎阴性只能说明你CD56没有染上，再做一遍吧

leeshamimi

我今天用全血又重新做了一次，
方法是：50 μl 全血+CD3-FITC、CD16-PEcy7、CD56-PE各20 μl，4℃孵育20 min，再加入390  μl 的红细胞的裂解液，4℃孵育10 min，直接上机。但是CD56+还是没有染上
是我的染色方法不对吗？@niwanmao
用同样的血样分离PBMC，测量CD16+有18%，CD56+有56%，是因为CD16-CD56+比较多的原因吗？今天这个血样感冒几天了，有可能是感冒导致CD16-CD56+增多吗？