细菌样品没办法区分设门，急啊！

zyfreely

用流式细胞仪检测细菌样品时（各种杂菌并非纯菌），Annexin V-FITC/PI双染后上机检测发现无法分群，细菌信号和噪声信号都在一起没办法区分，也就无法设门全出目的细菌分析。实验结果如下图：1、FSC-SSC图


图中貌似没有明显的细菌群体，感觉左下角那块都是背景噪音
2、PI信号图


使用Flow Jo可以检测到PI信号，说明样品中还是有细菌的。
初次接触流式细胞仪实验，我看网上其它细胞实验流式图中都有细胞分群的，我想问下为什么我的图中没有细菌分群，感觉和噪声信号都挤在FSC-SSC图左下角中去了，求大神帮我解答下。

niwanmao

你要检测的细菌大小大概多大？需要考虑用FSC和SSC的Log坐标来显示。

zyfreely

niwanmao 发表于 2017-3-23 19:28
你要检测的细菌大小大概多大？需要考虑用FSC和SSC的Log坐标来显示。

初次做这个我也不是太清楚细菌大小，环境中的样品，包含有细菌,真菌以及原生动物等等。采用LOG坐标也没有见到明显的分群。阈值我设置的为：SSC-40000

niwanmao

zyfreely 发表于 2017-3-24 08:37
初次做这个我也不是太清楚细菌大小，环境中的样品，包含有细菌,真菌以及原生动物等等。采用LOG坐标也没有 ...

阈值可以考虑用荧光触发。
FSC/SSC Log坐标不分群，可能说明获取到的是最大的这批吧，只能不断调整看看

chymanhz

我觉得你的阈值有点大，细菌一般在1um左右附近，你把阈值设小，同时用log显示，借助荧光反圈门，应该可以找到，C6的话，印象中最小可以测0.5um吧，但是你需要把你的管路清洗一下，建议用次氯酸钠当样本跑上一会，再用水跑上一会，类似于C6关机程序那步。

zyfreely

niwanmao 发表于 2017-3-24 19:29
阈值可以考虑用荧光触发。
FSC/SSC Log坐标不分群，可能说明获取到的是最大的这批吧，只能不断调整看看 ...

荧光触发怎么弄啊，第一次弄这个，实验室也没有人做过这个。
现在的分析是细菌和噪声信号合在一起，不知道从哪个角度考虑调整。T-T

zyfreely

chymanhz 发表于 2017-3-25 09:01
我觉得你的阈值有点大，细菌一般在1um左右附近，你把阈值设小，同时用log显示，借助荧光反圈门，应该可以找 ...

每次上样品时我都用超纯水做样品跑一会，直到counts/sec值低于10以下才开始上样。
第一次做不知道怎么弄那个荧光反向圈门，细菌的阈值一般为多少范围内合适啊。O-O

niwanmao

zyfreely 发表于 2017-3-26 18:39
荧光触发怎么弄啊，第一次弄这个，实验室也没有人做过这个。
现在的分析是细菌和噪声信号合在一起，不知 ...

嗯，发现你这个需要检测细菌的凋亡，Annexin V和PI可能没办法做。
本来像有些实验单纯做细菌核酸检测，所有的细菌都会染上核酸，就可以设置为核酸染料所在通道的荧光触发。

你这个实验有没有参考其它文章的做法？感觉这样没法实现凋亡检测的。

zyfreely

niwanmao 发表于 2017-3-26 18:58
嗯，发现你这个需要检测细菌的凋亡，Annexin V和PI可能没办法做。
本来像有些实验单纯做细菌核酸检测，所 ...

我看过的文献都只是大致提及了下样品预处理和实验结果，并没有明确的写出怎么测得。O_O

chymanhz

你主要研究什么，活菌落总数？