新技术：Imaging Mass Cytometry

niwanmao

尽管并非常规流式，但这些新技术还是挺有意思的，与大家分享！

Imaging Mass Cytometry（IMC）跟常规流式细胞仪原理不同，但还是有点类似的，它是是质谱仪的扩展，虽然不是分析悬浮液中的单细胞，但使用激光消融来产生粒子后，使粒子通过惰性气流携带到质谱仪检测的过程，却和常规流式细胞仪的液流有点像。

由IMC扫描的组织切片重建的图像具有与光学显微镜相当的分辨率，通过使用同位素标记的探针和ICP-MS检测可以实现高通量检测。 重要的是，IMC可以在石蜡包埋的组织切片上进行，因此可以应用于其结果已知的患者队列的回顾性分析，并最终应用于个性化医学。 自从2014年的原始描述以来，IMC已迅速发展成为前所未有的功能的商业工具，用于分析组织切片。

在质谱仪中，用抗体标记的单细胞或携带高质量标签的其他探针在电感耦合等离子体中进行电离，每个细胞的离子通过飞行时间（TOF）质谱法测量。通过将抗体与携带镧系稳定同位素的金属螯合聚合物结合来实现高通量分析，收集的数据显示并分析与高参数流式细胞术相似。最初在2014年Giesen C, Wang HA, Schapiro D等人在Nat Methods 2014;11:417– 422.发表了《Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry，将新型激光消融装置引入质谱仪。固定在载玻片上的组织切片或细胞用抗体片和其他探针染色，并插入到消融室中，其中通过在213nm下操作的脉冲激光扫描组织并聚焦到1mm直径的斑点大小。在每个激光射击时，来自消除斑点的组织被蒸发，并且通过具有高时间保真度的惰性气体流携带到电感耦合等离子体离子源中，以通过质谱仪同时分析（图1）。



与每个斑点相关联的金属同位素同时测量并针对每个斑点的位置进行索引。组件沿着扫描线逐点扫描，同时玻片在固定的激光束下方移动，顺序扫描后，最终产生遍及组织或感兴趣区域的所有靶蛋白的强度图。



因此，使用较小的激光光斑尺寸可以以降低的灵敏度为代价改善空间分辨率，因为从每个光点收集的离子较少，并且缩小了图像采集时间。 更高的速度（或每秒增加的激光烧蚀点）增加了图像采集的速度，而且增加了斑点之间材料交叉污染的可能性。 下面的图像是使用1mm的斑点尺寸获得的。 200像素/秒（或每秒的激光消融点）的扫描速度使得斑点之间的交叉污染<2％，产生锐利对比度图像。 在这个速度和激光光斑尺寸下，可以在<2 h内扫描一个平方毫米的样品区域。

IMC技术的应用范围
一、检测正常组织

正常小鼠皮肤


    图2、正常小鼠腹壁全层IMC图像，显示不同的解剖层。顶图：总离子电流；中间：beta肌动蛋白、组蛋白H3和铱嵌入剂；底图：E-钙粘蛋白、胶原和alphaSMA。 请注意，表皮层的E-cadherin和核标记组蛋白H3、DNA（阴影黄色）染色很强；真皮层胶原蛋白I染色很强；穿过皮下脂肪的血管是alpha SMA阳性的，腹壁横纹肌则是E-cadherin和beta-肌动蛋白阳性。



正常人睾丸、肾脏、前列腺

    图3、从组织微阵列获得的用于正常人睾丸，肾和前列腺的IMC模式。 每个器官的总离子电流显示在左列，由IMC成像的单个抗体的组合合成RGB图像，显示在中间和右侧两列，可突出每个器官的正常解剖特征。



正常人甲状腺

    图4、正常人甲状腺的IMC图像，含碘127的甲状腺激素直接成像



正常小鼠肠

    图5、正常小鼠小肠（上图）和结肠（下图）的IMC图像。 在处死前30分钟给予小鼠单次注射IdU。IdU掺入DNA后，便很容易在小肠的基底隐窝细胞中观察到，在结肠中稍微少一些。 增殖标记Ki-67（右图）显示与IdU相似的分布模式，但是染色更广泛，与其缺乏细胞周期相位特异性一致。



二、癌组织

肿瘤低氧环境

    图6、使用2-硝基咪唑示踪剂EF5显示胰腺癌患者来源的异种移植物中低氧的分布。 上图是整个IMC图像，显示典型的低氧分布，下图是特写，以说明缺氧微环境的一些特征。



细胞信号通路

    图7、磷酸化ERK和S6核糖体蛋白的组合标记，以及胰腺癌患者来源的异种移植物中的增殖标记Ki-67（上图）。 下图是来自第二个肿瘤，其中宿主小鼠用MEK抑制剂RDEA119处理以抑制ERK途径和mTOR抑制剂雷帕霉素。 这些信号转导抑制剂的双重治疗深刻地抑制了途径，并且与细胞周期停滞有关。



文献源（点击阅读原文，在线查看PDF，无需下载，支持划词翻译）：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTIzMDJ8NTY3NTJkNzB8MTczMjM2NzcyNnwwfA%3D%3D
    Chang Q, Ornatsky OI, Siddiqui I, Loboda A, Baranov VI, Hedley DW. Imaging Mass Cytometry. Cytometry A. 2017 Feb;91(2):160-169. doi: 10.1002/cyto.a.23053. Epub 2017 Feb 3.

sky1988

不错，值得点赞！！！

小憨

关键是，跟免疫荧光或共聚焦相比，不知道哪个颜色的是什么分子啊……

niwanmao

小憨 发表于 2017-4-20 18:05
关键是，跟免疫荧光或共聚焦相比，不知道哪个颜色的是什么分子啊……

可以的呀，是先用携带稀有金属元素的抗体标记的。

小憨

等于还是要用抗体标记啊……

niwanmao

小憨 发表于 2017-4-20 21:34
等于还是要用抗体标记啊……

是的，但是好处是可以利用原来保存在那里的病理标本，非常适合回溯性研究，同时可以结合组织结构。

小憨

niwanmao 发表于 2017-4-21 22:00
是的，但是好处是可以利用原来保存在那里的病理标本，非常适合回溯性研究，同时可以结合组织结构。 ...

晓得啦~又涨姿势了~