需要分选单个细胞，如何保证纯度和活性？

niwanmao

这是一篇发表在2017年4月3日Biotechnology杂志上的文章，作者是来自德国Boehringer Ingelheim GmbH & Co. KG的研发人员，这是一个著名的制药公司，我们身边很多药物就是他们生产的。文章主要是讨论，如何最高效地获取单个细胞克隆，保证克隆的纯粹性，这样生产出来的单抗药物才能真正一致、有效。

生物制药的各种生产细胞系研发，通常需要从异质性细胞群体开始，分选并建立单细胞克隆。许多监管指南都要求生产细胞系必须是单克隆性的，并且需要实际性的证明。因此，制药公司就开始了技术的研究。Boehringer Ingelheim GmbH & Co. KG的技术人员在文中描述的方法其实并不复杂：

1、利用流式细胞术分选单个活细胞，原理就是在FSC/SSC散点图上，选择状态好的核心细胞（如下图最左侧），然后再依次通过FSC-A/FSC-W、SSC-A/SSC-W，选择出单个活细胞。



2、光这样排除单个细胞还不够，将细胞对半分，一半染CFSE Green、一半染Cell Tracker Orange，然后以1：1混合后共培养过夜，上流式分选，于是就出现下面这样的图。下图中，从左到右、从上到下，依次是：未染色组、单染Cell Tracker Orange、单染CFSE Grenn、双染。在双染组，只有左上象限和右下象限单染的细胞才是单个细胞，用流式分选仪分选这两个象限的细胞。


不考虑原来培养物的粘连率或活性，这个方法获取的单细胞非常纯，纯度大约99.8％。

3、这样分出单细胞还不够。作者以1000×g离心3分钟获得最佳活性的细胞，然后以最佳浓度的Calcein AM标记细胞（约5uM），这个浓度既可保证良好染色，又可使得细胞活力最好。接着用亮场显微镜和自动荧光成像，再结合人眼确认，能够识别出99.82％的分选后粘连细胞（漏网之鱼），进一步保证了单细胞纯度。

4、最后进行克隆性验证，通过前面两种方式的层层保障，最后的单细胞克隆概率接近99.999％。

读了这篇文献之后，得到的体会是，无论是否制药行业，如果哪位FLOWER需要分选出好的单细胞，可以参考他们这种方式，具体的方法和步骤请点击『阅读原文』。


文献源（点击『阅读原文』，在线查看PDF，无需下载，并支持划词翻译）：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTIzNDV8YWQwMmE5OGZ8MTczMjIxODAyNnwwfA%3D%3D
    Fieder J,et al. A single-step FACS sorting strategy in conjunction with fluorescent vital dye imaging efficiently assures clonality of biopharmaceutical production cell lines. Biotechnol J 2017 Apr 3