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[干细胞相关] CD105阳性表达结果

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发表于 2017-6-20 11:32:22 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
本帖最后由 大礼 于 2017-6-20 11:41 编辑

各位前辈好,我是做干细胞的,用BDC6跑了一下流式,单独跑的间充质干细胞表型CD105,跑了4管,空白;同型;样本和同型跟样本混合后跑的结果,一般间充质干细胞表型CD105阳性结果是95%以上,为何我跑的结果不在正常范围内,因为是单独跑的CD105所以就不存在补偿问题,同样的样本别人跑的结果正常。附件1是我调整的结果图。剩下的几个是跑过流式原始图FCS文件格式,可以放在您们流式仪上帮忙分析一下,有以下几个疑问

  • 该样本的散点图中如何确定要研究的细胞也就是间充质干细胞。因为有两群细胞
  • 如果按照同型对照图马克线在2%以内的话,结果就偏低于95%,但如果混合后细胞按照阴性和阳性各50%左右计算结果就正常大于95%,那我是按照哪一个标准来得出最终的结果,我跑的空白和同型为何百分比变化那么大?
  • 还有就是同型对照的马克线要求在百分之多少以后得出的结果图算是准确的,2%以内正确吗?


麻烦传授一下经验,谢谢。

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发表于 2017-6-20 15:01:59 | 显示全部楼层
从附件的图片看,你这些细胞90%以上都是凋亡细胞或碎片,所以会对结果影响很大,会产生很明星的非特异性染色,所以使得你的结果出现很多超出常理的问题。
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 楼主| 发表于 2017-6-20 15:49:47 | 显示全部楼层
那倪老师怎么从图中判断90%以上的是细胞碎片和凋亡呢,在FSC/SSC中具体位置在哪里,怎么判断的,是反向设门吗?倪老师麻烦您教教如何反过来推论是细胞凋亡和死亡碎片,多谢多谢。
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发表于 2017-6-20 18:07:00 | 显示全部楼层
大礼 发表于 2017-6-20 15:49
那倪老师怎么从图中判断90%以上的是细胞碎片和凋亡呢,在FSC/SSC中具体位置在哪里,怎么判断的,是反向设门 ...

就是你圈中的这类勉强算活细胞,剩余的信号里面FSC小而SSC偏大的就是凋亡细胞,而FSC小、SSC小的就是碎片。
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 楼主| 发表于 2017-6-21 10:25:53 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-6-20 18:07
就是你圈中的这类勉强算活细胞,剩余的信号里面FSC小而SSC偏大的就是凋亡细胞,而FSC小、SSC小的就是碎片 ...

谢谢倪老师,不过那个流星怎么给您啊,还有老师我是不怎么会反向设门,老师有空的话就用我发的图,您在图中教教我怎么反过来确认死细胞和凋亡细胞的大概位置,可以在图里做,我学习一下。感激不尽,麻烦了谢谢。
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发表于 2017-6-21 19:42:10 | 显示全部楼层
大礼 发表于 2017-6-21 10:25
谢谢倪老师,不过那个流星怎么给您啊,还有老师我是不怎么会反向设门,老师有空的话就用我发的图,您在图 ...

流星不要紧。
你这几个图不需要通过反向设门就看的出来明显的凋亡和碎片。
反向设门就是你首先圈出某个CD分子阳性的细胞群,然后反过去看这些细胞在FSC/SSC散点图上的分布。
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 楼主| 发表于 2017-6-22 11:05:24 | 显示全部楼层
好的,谢谢老师的耐心解答,非常感谢
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发表于 2024-12-16 23:30:20 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-6-21 19:42
流星不要紧。
你这几个图不需要通过反向设门就看的出来明显的凋亡和碎片。
反向设门就是你首先圈出某个CD ...

倪老师,检测的MSC,做了105,73,90,CD45这4个指标,用的同型设门,目前出现个问题,CD105用同型设门的时候,阳性比例仅为45%左右,其余的几个指标都是符合MSC鉴定标准。有几个疑问想跟您探讨下,1应该可以排除MSC不纯的问题吧? 2同型的本底荧光,CD105染的PE,相比其他指标,是比较强的,是否同型抗体的问题多一些,可能选择的不合适,特异性不强,或者是抗体用量高了。3没有调节FITC对PE的溢漏,这个应该对结果影响不大,因为同型和样本的补偿是一样的
计划再做个CD105的FMO,CD105的同型,空白,再看下情况。倪老师有哪些建议吗?
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发表于 2024-12-17 10:01:31 | 显示全部楼层
wmj123456 发表于 2024-12-16 23:30
倪老师,检测的MSC,做了105,73,90,CD45这4个指标,用的同型设门,目前出现个问题,CD105用同型设门的 ...

1. 排除MSC不纯的问题?
虽不能完全排除MSC不纯的可能性,但可能性较低。虽然CD73、CD90呈阳性,CD45呈阴性,符合MSC的主要鉴定标准,但如果有可能,可以再加做几个ISCT建议的CD34、CD11b、CD19和HLA-DR等阴性标志物。如果这些阴性标志物中有阳性表达,则表明细胞群体中可能存在其他类型的细胞。


2. 同型的本底荧光,CD105染的PE相比其他指标比较强,是否同型抗体的问题多一些,可能选择的不合适,特异性不强,或者是抗体用量高了?
在科研中,同型对照设门虽然常用,但并非绝对可靠,之前我发过不少帖子说明。
因为很多时候同型对照跟靶标抗体在结合能力、亚型上未必匹配。
如果同型对照的荧光强度较高,可能会导致阳性细胞的比例被低估。

关于同型对照需要再多说几句:确保使用的同型对照抗体与CD105抗体的亚型(如IgG1、IgG2a等)一致,并且来自同一家公司。不同批次的同型对照也可能存在差异,尽量使用同一批次的同型对照。


3. 没有调节FITC对PE的溢漏,这个应该对结果影响不大,因为同型和样本的补偿是一样的?
我不知道你们FITC通道有没有用抗体,如果用了,还是需要调的
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