三个绝招，实现全血不裂红、不离心，直接检测

niwanmao

对于全血、骨髓等含红细胞的样本，进行表面抗体标记时，流式细胞术检测的标准步骤是：
1、加抗体；2、加样本，孵育15分钟；3、加裂解液，裂解红细胞10分钟；4、离心去上清

这已成传统、经典的标本处理步骤。   

在很多时候，这个步骤没问题，几乎所有的文章都是用这个方法。然而，人的需求总是无限的，当遇到下面的情形的时候，我们可能希望能够不裂红、不离心，能够标记完直接上机检测，尽量减少细胞损失：
－ 细胞稀有，比例非常低（例如抗原特异性细胞、造血干祖细胞、内皮祖细胞等）
－ 样本珍贵，并且量少，而其中的细胞较脆弱（例如脑脊液等体液样本）
正是如此，学者们进行了一些探索，经过大致检索，总结起来以下三类：


1、利用紫色激光侧向散射光
原理是利用红细胞和白细胞的光散射特性差异。红细胞中包含血红蛋白，血红蛋白分子可以吸收紫色激光 (405 nm)，而白细胞不含这种分子，因此，使用蓝色 (488 nm)和紫色(405 nm)侧向散射(SSC)观察人的全血时，可以观察到一种独特的散射图谱(见下图)。


图1、Attune NxT流式细胞仪，配合Attune NxT No- Wash No-Lyse Filter(货号:100022776)，可无需裂解和洗涤，蓝光SSC (x轴)与紫光SSC (y轴)，均选择对数，就可区分全血中的白细胞、红细胞。天蓝色为红细胞，绿色为血小板，紫红色为白细胞。

这个方法纯物理学，无需额外的染料，省时、省力、省钱。不过这个原理比较适合能够高速、高精度获取大量数据的新式流式细胞仪（Attune NxT流式细胞仪等），而对于常规流式细胞仪可能有难度，一个是因为大多数常规流式细胞仪都是光路固定，另一个是因为获取了红细胞后，数据量十分大，并且要求高速获取的同时保持高精度。

2、核酸染料

粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、干细胞等都是有核细胞，而成熟红细胞是无细胞核的，所以通过核酸染料，可有效区分红细胞和白细胞。

目前使用的核酸染料大多是可直接透过细胞膜的活细胞核酸染料，例如VybrantTM DyeCycleTM系列染料、DRAQ5、SYTO13等。


图2、在Attune NxT流式细胞仪上使用Vybrant DyeCycle染料鉴别人的全血中的白细胞。(A) 使用Vybrant DyeCycle Ruby染料标记人的全血，横坐标为DyeCycle，红色为DNA阳性的白细胞，绿色的为DNA阴性的红细胞。(B) 在A图上选择Vybrant DyeCycle Ruby阳性的白细胞，显示在蓝色激光FSC/SSC散点图上，清晰地分出全血三种主要的白细胞群体：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。(C) 使用Attune NxT No-Wash No-Lyse Filter配套元件（即第1种方法）确认Vybrant DyeCycle Ruby染料能够鉴别全血样本中的白细胞。


图3、用DRAQ5标记骨髓，与Vybrant DyeCycle相似，有核的白细胞为阳性，无核的成熟红细胞为阴性。


图4、用CD45/SSC验证细胞分群情况，A图为DRAQ5标记骨髓细胞，不裂红、不离心，B图为常规标记步骤，裂红、离心。


图5、用SYTO13染料联合CD45（同一通道）标记白细胞，结合CD34和绝对计数微球，实现CD34＋干细胞不裂红、不离心绝对计数。a/b/c/d为依次设门步骤。


3、使用GlyA和CD45标记
红细胞表达血型糖蛋白A（GlyA），白细胞表达CD45，结合这两种抗原，可以明确鉴别红细胞和白细胞，通过设门排除红细胞的干扰。


图6、利用CD45和GlyA检测全血，不裂红、不离心。在CD45/GlyA散点图可见CD45＋GlyA－的白细胞，CD45－GlyA＋的红细胞。

如果不涉及到白血病或实体肿瘤标本，也可以考虑只用一个CD45，通过CD45/SSC设门，排除掉红细胞，如下图：


图7、CD45/SSC散点图，排除掉CD45－的红细胞，剩余为白细胞，选择CD45＋＋SSC小的淋巴细胞后，在CD4/CD8散点图是清晰地分成三个主要亚群。


这三个不裂红、不离心的流式检测方法，第一个方法最简单，但需要仪器配置紫光SSC通道，目前已知Attune NxT流式细胞仪上可以，第二个和第三个方法除了Attune NxT流式细胞仪之外，常规流式细胞仪也可使用，但需要注意阈值的设置，避免因为过多红细胞而导致文件过大和白细胞信号丢失。

你想试试吗？你知道的还有其它方法吗？留言分享一下吧！



参考源：
Thermo Fisher AttuneNxT流式细胞仪产品手册
Attune NxT App Notes01无需洗脱裂解检测人全血中的白细胞
Alberto Alvarez-Larran et al.A Multicolor, No-Lyse No-Wash Assay for the Absolute Counting of CD34＋Cells by Flow Cytometry. Cytometry (Clinical Cytometry) 50:249–253 (2002)
Robert W. Allan, et al. DRAQ5-Based, No-Lyse, No-Wash Bone Marrow Aspirate Evaluation by Flow Cytometry. Am J Clin Pathol 2008;129:706-713