细胞分选后计数问题

seawidesky

        aria II 分选人MDSC细胞，发现流式细胞仪自身计算的数目和实际分选后手动计数（不离心）数目差别较大，发现实际数目只有分选软件计数的60%，后来尝试分选肿瘤组织中淋巴细胞，是同样的情况。这个是什么导致的呢？
        液流调节没有问题，液路偏转打在收集管中央位置，而且镜下计数时几乎没有细胞碎片。

niwanmao

流式细胞仪自身计算的数目是指什么？

seawidesky

niwanmao 发表于 2017-7-13 14:33
流式细胞仪自身计算的数目是指什么？

就是分选的时候，机器会自己计算个分选数目

niwanmao

seawidesky 发表于 2017-7-13 16:33
就是分选的时候，机器会自己计算个分选数目

那个计数如果跟普通分析型流式细胞仪一样的话，应该并非是定量吧，因为体积不知道。所以跟手工计数不能对比的

seawidesky

niwanmao 发表于 2017-7-13 18:55
那个计数如果跟普通分析型流式细胞仪一样的话，应该并非是定量吧，因为体积不知道。所以跟手工计数不能对 ...

这个计数是检测到是目的细胞，然后加电，偏转分到管子里面的细胞数目

niwanmao

seawidesky 发表于 2017-7-14 09:49
这个计数是检测到是目的细胞，然后加电，偏转分到管子里面的细胞数目

这个计数，不能保证计数到肯定就是细胞，也可能是非特异性荧光信号，或许碎片粘连造成的假信号 ，所以这个数量肯定会比最终收集到的真实细胞量要大。

Minions

分选仪分选时计数会比人工计数会正确点吧，分选仪加电是加到具体细胞上的！分选了多少个细胞，机器都很准确地计数！如果排除了机器问题，工人计数的正确性是否可靠？机器计数的计数正确性远远高于工人计数~

didi_zhou

这个情况实际上是比较普遍的，这个跟分选仪的设计或实验细胞条件很多情况有关系。因为仪器对细胞的计数实际上是检测到符合分选条件的细胞（包括你的设门及分选模式都符合），但是是否这个细胞最终分选到你的接收器里面，或者以完整的细胞形态分选到你的分选接收器里面都是不一定的。

出现这种状况你可以从多个方面去验证这个问题。一般可以先用微球去排除仪器设置问题或仪器本身的不准确（使用多分群的微球会比较好）。一般来说，微球非常均一，且不会出现碎裂，可以排除细胞或样本制备本身问题。如果微球的准确度及得率都比较符合要求（纯度99%，得率95%以上）那就说明你仪器设置没有问题。这个时候你可以去考虑改进你的实验条件，比如制备环节、系统压力、喷嘴大小、接受管里面液体条件等等。其实关于这个东西的影响还是挺多的。

有关Aria系列，理论最高得率也就80%，你这个有60%我觉得还是挺不错的了，10%以下的也听过。反正如果对得率要求特别高可以尝试以下优化条件，已经60%了，可能提高空间有限。

wangjijun

我的最终分选细胞与机器所显示的分选数目是10%，n次的分选，手工计数 结果都是差不多

miliamlau

didi_zhou 发表于 2017-8-5 15:32
这个情况实际上是比较普遍的，这个跟分选仪的设计或实验细胞条件很多情况有关系。因为仪器对细胞的计数实际 ...

分选仪显示的分选数量是符合分选条件并且进行充电的细胞数量，是净分选数量，跟非特异荧光、碎片、粘连体、电子死时间、冲突事件都没有关系，除非在gating时就没排除干净。

理论上，收集到的细胞数量应与分选仪显示的分选数量相等。实际也应在80%以上。

最有可能导致分选数字与实测不符的因素有：
1. Drop Delay不对（没设对或使用中液流参数飘了），导致充电错误，空液滴被分选。当然你这细胞纯度也肯定好不了。
2. 细胞状态不好，导致分选后很快死亡崩解，不留痕迹。
3. 分选时，容易在接收管中的培养基液面上堆积成无色的鞘液层，细胞在鞘液层中得不到培养基支持，也容易死掉。解决办法是分选一段时间后暂停，把接收管中的液体摇匀。
4. 细胞与喷嘴匹配不好。一般情况下，细胞直径不超过喷嘴的1/5，最多不超过1/4。细胞太大易受剪切力损伤。5. 液滴偏转不稳定。明明用Test sort瞄准的时候已经打到液面中央了，分选时还是会有一部分跑到管子外面去。
6. 水冷机。分选出的细胞要长时间呆在收集管里，保持收集管的低温对细胞存活很重要。