设置补偿对照的三大准则

niwanmao

如果没有正确的补偿对照，我们是无法进行荧光补偿调节的，因此在准备实验时，花费时间和精力来设置高质量的补偿对照非常重要。
补偿对照是由于荧光素发射光不是一个单一的波长，而是覆盖一定范围，所以容易使荧光渗漏到邻近波长的检测器。在单个实验中测量的颜色越多，越容易发生荧光渗漏。
补偿是一个数学过程，通过去除每个检测器中邻近通道渗漏的荧光百分比来解决这个问题。

设置高质量的补偿对照有三大准则：
1、每个补偿对照必须与实验样本一样亮或更亮。
见下图，如果你用于设置补偿的阳性群为弱表达的，那么其中位值与阴性群的中位值连接线可能偏离高表达的细胞群体，所以需要用尽可能高表达的补偿对照来调节补偿。


2、对于每个通道中用于补偿计算的阴性群和阳性群，自发荧光水平应该相同。
见下图，如果阴性群和阳性群的自发荧光水平不一致，那么就容易导致补偿错误。


3、使用的荧光素必须是在实验样品中使用的荧光素，应该完全一致，不能用相似波长的其它荧光素替代。
例如你需要调节FITC与PE之间的补偿，那么FITC就不能用GFP替代。



编译源：
https://expertcytometry.com/guid ... ometry-experiments/

zj8237277

倪老师，对于第一条，我没有理解，还请帮再解释一下，好嘛？ 谢谢！

niwanmao

zj8237277 发表于 2017-7-19 18:18
倪老师，对于第一条，我没有理解，还请帮再解释一下，好嘛？ 谢谢！

就是说，每个荧光通道，都要选择最亮的荧光素进行补偿调节，才能使得补偿准确。
例如你要检测CD25 FITC，由于该抗原在淋巴细胞上表达并不很强，所以建议用CD3 FITC调节补偿值，才能准确。

zj8237277

倪老师，为何要选择最亮的呢？   用本身的不是更为准确嘛？

niwanmao

zj8237277 发表于 2017-7-20 11:33
倪老师，为何要选择最亮的呢？   用本身的不是更为准确嘛？

原因看上面的图，第1点下面的图画的非常清楚了：）

zj8237277

好的，谢谢倪老师！

arcangeli

倪老师，第二条不懂呢

niwanmao

arcangeli 发表于 2017-10-24 08:44
倪老师，第二条不懂呢

自发荧光背景一致，这样才能够排除掉同样的背景，获取准确的补偿值。

1269189831

倪老师，仪器自动补偿的时候是可以选择以中位值为标准，还是以平均荧光强度为标准的，具体选择中位值还是平均荧光强度呢

niwanmao

1269189831 发表于 2019-4-24 23:53
倪老师，仪器自动补偿的时候是可以选择以中位值为标准，还是以平均荧光强度为标准的，具体选择中位值还是平 ...

自动补偿不需要你设置的，仪器自动会根据中位数调整的。