流式细胞仪是怎么“看见”光的？

niwanmao

不单单流式细胞仪，其它化学发光、生物发光检测仪器，以及影像科仪器（包括CT、MRI等）也都涉及到将电磁信号转换为电子信号的过程（光也是一种电磁信号）。实现光电转换的电子元器件目前主要有4大类：

• 光电倍增管（PMT）
• 硅光电倍增管（SiPM）
• 雪崩光电二极管（APD）
• 硅光电二极管
  

在流式细胞仪上用的主要是PMT和APD。从制造之初就开始用PMT，到最近几年，有些仪器开始使用APD。那么这两种光学器件究竟长什么样？有什么区别呢？下面我们逐层解剖看看。


PMT

PMT结构图


PMT元器件

PMT由真空玻璃或金属外壳内的光敏表面（光电阴极），电子倍增器（倍增极）和收集电极（阳极）组成。 光进入输入窗口并被光电阴极吸收。 电子从阴极发射并通过施加的电压加速到第一倍增电极。 电子被加速到足够的电势，当它与倍增极碰撞时，产生二次电子。 这些二次电子又被加速到下一个倍增电极，重复该过程直到在阳极收集电子云。


APD

APD结构图


APD元器件

APD是一种以高反向偏置电压为特点的硅PIN光电二极管。 高反向电压在PN结处产生高电场。 在该场中通过或产生的一些电子 - 空穴对获得足够的能量（大于带隙能量）以产生额外的电子 - 空穴对。 这个过程称为冲击电离。 如果新创建的电子 - 空穴对获得足够的能量，它们也产生电子 - 空穴对。 这被称为雪崩倍增，是APD产生内部增益的机制。


PMT和APD的对比

通过图形观察，两者之间的性能差异特别浅显易懂。
首先看APD和PMT的量子效率。APD从400nm到1000nm都有着很高的量子效率且要远远高于PMT。由于PMT的检测效率在800nm以下，因此很多长波段的染料的应用得到了限制，APD的可以更好的拓展这些染料的使用。


APD和PMT的量子效率

其次是荧光CV值。从下图看，PMT的CV值整体大于APD，但在发射波长600nm以下差别不显著，600nm以上PMT的CV值逐渐增大，800nm以上PMT的CV值更是急剧增高，而APD的CV值均稳定在1％左右。


不同波长发射光PMT和APD的CV值变化

最后是微球、细胞的分群能力。


585nm波长下，微球和单个核细胞的荧光信号分群，PMT和APD无显著差异


690、700、800nm波长下，微球的分群情况，PMT在弱荧光信号上分群能力明显差于APD，尤其是800nm以上，更是出现少峰现象


800nm波长下，单个核细胞的荧光信号分群，与微球相似，PMT亦出现阳性峰缺失现象，而APD则能显著分出一个小阳性峰



参考文献
[1] A comparison of avalanche photodiode and photomultiplier tube detectors for flow cytometry. Conference Paper in Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering 6859:68590M-68590M-11 · March 2008
[2] https://www.photonics.com/EDU/Handbook.aspx?AID=25535
[3] High gain avalanche photodiode (APD) arrays in flow cytometer opitical system

ZHENGLIYAN

讲的很深入了，牛

1myourmrz

很有帮助，向老师请教一个问题，PMT或者APD采集到的原始信号是不是以电压值展现的，可以直接将原始电压信号做直方图吗？我看关于荧光检测的作图都是以对数（log）为横坐标。我在做测试的时候是直接将采集到的APD电压信号作图，但是在8峰彩虹微球标定的时候，作图却难以区分，荧光直方图是连在一起的很宽的峰。因此我推断我在原始电压信号到可以作图的荧光信号之间缺少相应的数据处理方式，看了关于荧光强度的单位的帖子之后，我想是不是在采集荧光信号的时候要有一个荧光标准品先测试进行数据标定，再将测得的数据做归一化处理才能做数据处理，然后作图分析呢？