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用live/dead kit试剂盒做细菌染色,各位老师看看我的图是否...

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发表于 2017-7-21 20:16:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

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学院新买的贝克曼CytoFLEX,基本没人会用,所有条件只能靠自己摸索,文献看了不少,在论坛也学习了很多东西,找到一个也用live/dead kit做细菌染色的帖子,按照上面的信息自己做了一次,不知图有没有错。


有几个问题想请教各位老师:
1.样品是金黄色葡萄球菌,直径也就0.8微米-1微米左右,很小,不知道增益和阈值设置有没有错。FITC,PE,ECD这三个值是一篇文献上找的。FSC和SSC这两个值是自己设置的,其余是默认值,不知道合不合适
2.阈值是自己设置的,不知道合不合适,总觉得FSC-SSC图不太对,默认值是10的四次方,是在太大,于是从小开始设,
3.没有做荧光补偿,不知需不需要
4.收集的events在3W-4W左右,不知是否足够
5.菌液浓度在OD600 0.08,先前第一次做的时候因为不会调阈值,这次阈值调小了之后发现这个浓度太高了,应该0.03-004比较合适


希望各位老师赐教,不胜感激
还做了活细菌然SYTO9等等图,因为太多了就不一一放上来,如果老师需要看可以联系我


死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

死细菌+PI染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

一半活和一半死+PI和SYTO9染色

阈值

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增益

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发表于 2017-7-22 13:33:39 | 显示全部楼层
小红子 发表于 2017-7-22 10:37
谢谢老师的回复!我还有几个小问题不知老师可否解答一下
1.一半活和一半死+PI和SYTO9染色的FITC-ECD图中 ...

FITC和ECD散点图类似直线形状跟补偿有关,把FITC-ECD和ECD-FITC调大即可,CytoFLEX可以调节数字,也可以直接拖,只要调到分群比较圆即可。


噪音和菌体,如果你通过Buffer确认过没问题了,那就可以了。BD机器的FSC和SSC区分度确实不错的,其它机器如果分不开,但是你这样确认过了,还是可信的。
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发表于 2017-7-21 22:53:11 | 显示全部楼层
用这几个散点图效果挺好的啊。由于在Beckman的仪器上,ECD和PE之间补偿很大,所以PI在ECD、PE通道均可检测。

1、每台仪器的增益和阈值都会有不同,所以无法给你明确的回复,但从检测结果看,是可以的。
2、同上。
3、补偿要调节的,ECD-FITC调大一些。
4、events 3~4万可以,更多当然更好。
5、菌液如果浓度太高,一个可以稀释,另一个可以减慢获取速度。


结果挺好的,加油!!!
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 楼主| 发表于 2017-7-22 10:37:36 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-7-21 22:53
用这几个散点图效果挺好的啊。由于在Beckman的仪器上,ECD和PE之间补偿很大,所以PI在ECD、PE通道均可检测 ...

谢谢老师的回复!我还有几个小问题不知老师可否解答一下
1.一半活和一半死+PI和SYTO9染色的FITC-ECD图中出现了类似直线的形状,不知这是否正常?老师知道是什么原因引起的吗?
2.ECD-FITC调大一些不是很理解?因为这台机子只能在图上拖动调补偿而不能直接设置数字,拖动的时候鼠标出现一行小字(如 -FITC X%),我不是很懂这行小字的意思,不知老师可否解释一下?
3.在SSC-FSC图中好像没明显分出噪声和菌体,以前导师用BD的机子做好像是做出来明显的区分的,图如下,所以我很想知道是否是阈值设置的问题导致没分出来。但我按照这个阈值跑了一次buffer,发现events/s 值很小,但一上样品,值就飙到上万了。


搜狗截图17年07月22日1033_1.png
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