固定和破膜的一些诀窍

niwanmao

在流式细胞术实验中，经常需要检测胞内、核内抗原，于是势必用到固定和破膜。在此介绍一些经典的固定和破膜方法，以及注意事项。

固定剂
多聚甲醛
原理：使赖氨酸残基之间发生交联
浓度：0.5～4％
保存时间：固定后，保存于PBS中可稳定1～2周。

乙醇
原理：通过沉淀、失活起到固定作用，所以可能会使蛋白聚焦，结合位点丢失。同时可溶解脂质起到破膜作用。
浓度：70％乙醇或甲醇
保存时间：4度或－20度保存数月。

破膜剂
主要有两大类：
（1）有机溶剂：例如甲醇、丙酮等，这类溶剂主要通过溶解膜脂质、凝结膜蛋白实现固定和破膜。
（2）去污剂：这类试剂可在胞膜上形成一个孔实现破膜，如皂素、Tween-20、Triton-x等去污剂。
详见站内帖：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5191-1-1.html

破膜时，需要注意：
（1）荧光素尽量选择小分子，PE和APC属于大分子可能会使破膜后的染色效果差。
（2）需考虑靶蛋白的大小，如果靶蛋白太小，破膜后可能会使其漏出，导致结果假阴性。

胞内染色的注意点
1、抗原表位和荧光素均可能对固定剂敏感，所以需要注意测试。
2、先染表面标记，然后再固定、破膜染胞内。
3、有可能，尽量用商品化固定破膜剂。
4、如果用自配的，可能全程都要用到去污剂成份，包括洗涤时。
5、使用预冷的固定剂，因为固定过程是一个放热反应。
6、固定会改变细胞大小。
7、边加固定剂，边振荡，可以避免细胞成团。
8、在胞内染色组合中，尽量避免用生物素和FITC，因为对前者而言，内源性生物素可能会影响染色，对后者，FITC可能容易发生非特异性结合。



参考文献：
https://www.youtube.com/watch?v=oeqiCa3nEwc&t=678s

hbezyr

倪老师，你提到的youtube视频，我这边正好有下载好的https://pan.baidu.com/s/1hrNnLp6
wasj

南瓜妹妹

倪老师，我做单核细胞胞内染色，发现破膜与不破膜相比，SSC变小很多，分群很不明显，LPS刺激后CD14也存在表达下调的情况，不像破膜之前有阴阳性两群，而是好几群，这种情况需要调大ssc和fsc的电压吗？该怎么改进呢？我染的胞内IL-10-APC好像也没有染上，但是tgfb-Percp5.5可以染上，做Treg也存在ssc变小的情况