Flowjo分析数据，射门相关

MAILILIUSHI · 发表于 2017-8-18 11:01:55

本帖最后由 MAILILIUSHI 于 2017-8-18 11:06 编辑

流式菜鸟，想咨询几个问题，1.应用同型对照射门标准是什么，应该表阳性界定在多少以内，2. 四色染一管，分析四色阳性的细胞需要第三次射门吗？在同型中如何设四色阳性的门？

我想成大牛 · 发表于 2017-8-18 17:32:53

1 你的实验需要阴性对照（啥都不染），这个才是你确定阴性阳性的依据。同型对照是不能用来界定阴性阳性的。没有具体的数值，你的细胞分了两群，信号高的就是阳性，一般阳性群在10^3左右或更高。
2 4色染，就要看你的目标群了，比如你需要CD4+IL2+的细胞，宁外还有CD3，CD8，你就可以设2个门，第一个们：CD3/CD8，选择CD3+CD8-。第二门：CD4/IL2，选择CD4+IL2+。具体看你的染色分子搭配。
3 同型对照相同设门就好。

niwanmao · 发表于 2017-8-18 19:28:29

补充@我想成大牛兄的观点，设门标准应该是生物学阴性对照最佳，其次是FMO对照。

MAILILIUSHI · 发表于 2017-8-21 21:16:33

本帖最后由 MAILILIUSHI 于 2017-9-13 23:40 编辑

我想成大牛发表于 2017-8-18 17:32
1 你的实验需要阴性对照（啥都不染），这个才是你确定阴性阳性的依据。同型对照是不能用来界定阴性阳性的。 ...

非常感谢您的详细解答

MAILILIUSHI · 发表于 2017-8-21 21:20:50

本帖最后由 MAILILIUSHI 于 2017-9-13 23:40 编辑

niwanmao 发表于 2017-8-18 19:28
补充@我想成大牛兄的观点，设门标准应该是生物学阴性对照最佳，其次是FMO对照。 ...

谢谢老

niwanmao · 发表于 2017-8-21 21:59:51

MAILILIUSHI 发表于 2017-8-21 21:20
谢谢老师，目前有点怀疑自己的实验设计了，染CD4、PD-1、CD127、CXCR5四色，设了空白、同型、目的管，需 ...

你是要测Treg上的PD-1表达？

MAILILIUSHI · 发表于 2017-8-21 23:05:41

本帖最后由 MAILILIUSHI 于 2017-9-13 23:42 编辑

嗯嗯，对的，谢谢

niwanmao · 发表于 2017-8-22 13:54:57

MAILILIUSHI 发表于 2017-8-21 23:05
Tfh上PD-1的表达

不知道你的荧光素搭配是怎么样的，如果是这样的话，你可以设一管FMO对照：
CD4、CD127、CXCR5
做之前用Fc Blocking Solution阻断一下即可，就可以作为PD-1的设门参照。

我想成大牛 · 发表于 2017-8-22 15:19:55

niwanmao 发表于 2017-8-22 13:54
不知道你的荧光素搭配是怎么样的，如果是这样的话，你可以设一管FMO对照：
CD4、CD127、CXCR5
做之前用Fc ...

倪老师的建议很好。多色流式好像很少做同型对照，你分析的时候只要没有发现很明显的非特异性杂质（出现不该存在的信号很高的一群或者45°的斜线上很多点之类的问题），个人感觉问题不大。另外，Tfh细胞比较少，PD-1+的会更少一点，分群有点弥散，但是阴性主体还是会很明显的，你可以参照对照管，应该不会很难，只要你圈选时尺度统一，不太会影响分析。

MAILILIUSHI · 发表于 2017-8-22 15:58:09

本帖最后由 MAILILIUSHI 于 2017-9-13 23:42 编辑

niwanmao 发表于 2017-8-22 13:54
不知道你的荧光素搭配是怎么样的，如果是这样的话，你可以设一管FMO对照：
CD4、CD127、CXCR5
做之前用Fc ...

四色荧光组合老师您的建议是空白、FMO对照、目的管，这样吗？

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