同一个公司，同一个marker，不同的染料标记，结果差异很.....

去归来兮 · 发表于 2017-9-8 00:45:21

本帖最后由去归来兮于 2017-9-8 00:52 编辑

最近在做细胞内Nestin表达的流式，由于是胞内蛋白，所以用破膜标记。
标记模式：破膜单标

破膜固定kit：BD

Protocol：
1.细胞洗涤后用BD kit A 固定，4℃ 30min
2.用BD kit B清洗 2x 并加入分别加入BD kit B+目标抗体和BD kit B+ISOtype，4℃ 30min
3.用PBS 清洗定容，上机检测（BD kit操作按说明书）

抗体用的是R&D
hNestin APC
hNestin PE
两种对比

ISOtype为对应的ISOtype，确认无误。

结果如图
未标题-4.jpg

问题：
为什么同样的细胞，同样的处理方法，同个公司的抗体，同样的marker，只是不同的染料标记，他们的结果差异那么大，没办法取个标准·····
求大神解答~

niwanmao · 发表于 2017-9-8 00:45:22

首先你看一下克隆号是不是一样？
其次，如果你用散点图Nestin/SSC来设斜向门，图类型改成密度图，不要根据同型对照，设在阳性和阴性分界处，差距应该不会太大。
为什么不应该参照同型对照设门，以前说过，因为要挑到一个完全匹配的同型，比找老婆还难，如果真要用，你在染色之前都必须进行Fc Blocking。

ghqiu09 · 发表于 2017-9-8 08:47:33

ssc-nestin的点图把点数调少一点，感觉还是有点分群的，设门可能太靠左了

a86856635 · 发表于 2017-9-8 16:31:50

没有排除粘连体，抗体用量要滴定，你的仪器APC的信号比PE强，可以SSC-荧光通道圈门分析下

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[标本处理] 同一个公司，同一个marker，不同的染料标记，结果差异很.....

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