固定后细胞那烦人的自发荧光，怎么办？

niwanmao

特异性荧光染料和荧光蛋白表达被广泛应用于基础研究和临床试验，获得了极大的成功，但在许多情况下，自发荧光或背景荧光仍然是一个问题。 虽然在流式细胞术中，术语“自体荧光”通常指紫外光照射或紫光、蓝光照射产生的背景荧光，主要表现为绿光，但实际上，也可以在更长的波长处观察到自发荧光。

下图总结了哺乳动物细胞中背景荧光的一些来源及其激发波长和发射波长：

哺乳动物细胞中背景荧光的一些来源及其激发波长和发射波长

由此可见，自发荧光对各个通道都可能有影响，特别是甲醛固定之后，自发荧光更加明显。为了减少固定标本的自发荧光，科学家们想了各种办法：
1、采用淬灭自发荧光的试剂，例如台盼蓝、铬黑T或苏丹黑B。
2、采用还原性化学试剂，例如硼氢化钠。
3、在显微镜成像上，还有用强光淬灭自发荧光的方法。

究竟效果如何？

Shilova ON等人在2017年8月30日的Cytometry A上，在三组样本上验证了台盼蓝降低自发荧光水平的作用：
1、4％甲醛固定
2、4％甲醛固定后再以Tween20破膜
3、加热
4、乙醇固定

各样本首先上机检测自发荧光水平，接着用0.4％台盼蓝溶液孵育10分钟，以PBS洗涤两次后，再次上机检测自发荧光变化效果。

作者共检测了SK-BR-3细胞株、CHO细胞株、胸腺细胞三种样本，每种样本分前述4组，结果见下图（浅色柱表示未加台盼蓝，网状柱表示加台盼蓝）：

SK-BR-3细胞株、CHO细胞株、胸腺细胞三种样本，每种样本分前述4组

可见，只有在FL1（488nm激发，525/40nm发射）通道，台盼蓝才能发挥降低自发荧光的作用，而在其它通道，不仅无法降低自发荧光，反而推波助澜。

因此，如果你检测的细胞在FL1有明显的自发荧光，可以考虑用一下台盼蓝试试。

参考文献：
Shilova ON, Shilov ES, Deyev SM. The effect of trypan blue treatment on autofluorescence of fixed cells. Cytometry A. 2017 Aug 30. doi: 10.1002/cyto.a.23199.