基因魔剪—CRISPR/Cas9系统（二）

infouniv

  能够方便而精确的对DNA和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想。CRISPR/Cas9系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。CRISPR/Cas9系统，作为第三代基因编辑技术，它的本质其实是细菌中一种对付诸如噬菌体等外来DNA的主动防御机制。此系统的工作原理是通过成簇的、规律间隔的短回文重复序列的crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割，从而进行基因敲出等操作。本期小优专题之CRISPR/Cas9篇的第二部分将为您带来CRISPR/Cas9系统最为广泛的应用—基因敲除，以及优宁维中为您提供的相关产品与服务。

1. CRISPR/Cas9敲除质粒产品

产品说明：

20 μg，可做20个转染体系；

CRISPR/Cas9敲除质粒是一个包含三种编码Cas9核酸酶以及目标特异性的20 nt的向导RNA的质粒组成的，力求达到最高的敲除效率；

gRNA序列由GeCKO（v2）数据库设计，引导Cas9蛋白对目标基因组DNA进行位点特异性的切割，产生双链断裂；

CRISPR/Cas9敲除质粒支持人与小鼠的基因敲除应用，产品分别用名称后面的（h）与（m）标记区分；

提供纯化的质粒，可以直接进行转染实验。

图1. CRISPR/Cas9敲除质粒工作原理示意图

  2. 同源重组修复（HDR）质粒

  ①HDR质粒特点：

  HDR质粒提供了一个特异性的DNA双链断裂修复模板，只能与CRISPR/Cas9敲除质粒共转染使用；

当与CRISPR/Cas9敲除质粒共转染时，HDR质粒包含一个嘌呤霉素抗性基因，方便筛选存在Cas9诱导的DNA剪切的细胞。

②产品说明：

  20 μg，可做20个转染体系；靶向特异的HDR质粒需与CRISPR/Cas9敲除质粒共转染使用，针对相同种属与靶基因。

  HDR质粒包含2到3个质粒，每个都包含一段与CRISPR/Cas9质粒切除位点附近序列一致HDR修复模板；每一个HDR模板包含两条800bp的同源臂，特异性的结合到相应的Cas-9介导的DNA双链断裂位点上下游；每一个HDR质粒插入了一段嘌呤霉素抗性基因，来辅助筛选稳定敲除的细胞；每一个嘌呤霉素抗性基因两侧都加入了LoxP位点，方便后期通过Cre载体切除；HDR载体也包含红色荧光蛋白，方便观察确认转染效率；提供纯化的质粒DNA，可直接用于转染。

图2. HDR质粒工作原理示意图

3. Cre载体（货号sc-418923）

  ①Cre载体特点：

  Cre载体表达Cre重组酶，一种噬菌体p1酶，能够催化两个LoxP位点间的DNA重组；

当CRISPR/Cas9敲除质粒与HDR质粒共转染后，包含编辑过的DNA的细胞可以被在HDR修复过程中插入的特异性标志物筛选出来；

在选择出来之后，细胞可以转染Cre质粒，将在HDR过程中插入进去的遗传物质切除掉，比如插入的嘌呤霉素抗性基因等。

  ②产品说明：

  20 μg，可做20个转染体系；推荐用于对被筛选出的成功由CRISPR/Cas9敲除质粒与HDR质粒进行过基因编辑锅的细胞；

提供纯化过的质粒，可直接用于转染。

图3. Cre载体工作原理示意图

  4. 双切口酶质粒

  产品说明：

  20 μg，可做20个转染体系；

  双切口酶质粒包括一对各自编码了一个带有D10A突变的Cas9核酸酶和一个20 nt向导RNA（gRNA）的质粒，在敲除目的基因时相对于CRISPR/Cas9敲除质粒具有更高的特异性；一对gRNA序列识别位点彼此偏移大约20个碱基左右，特异性的Cas9调节的双切口酶对DNA进行切割，模拟基因组DNA的双链断裂；

一对质粒其中一个含有嘌呤霉素抗性基因，方便药物筛选，而另一个质粒含有GFP标记物，方便观察确认转染效率；双切口酶系统支持人类与小鼠基因敲除应用，产品分别用名称后面的（h）与（m）标记区分；提供纯化的质粒，可直接用于转染。

图4. 双切口酶工作原理示意图

  以上就是小优为您介绍的CRISPR/Cas9在基因敲除应用中涉及的产品，不知道大家是不是对利用CRISPR/Cas9这把锋利的“基因魔剪”进行基因编辑更加有信心了呢？科研路上，小优陪伴，优质产品，助力科研。