Th1/Th2包内染色IFN、IL-4一直染不上

熊爱吃西瓜

最近在做Th1/Th2,用的是BD Accuri C6检测，FlowJo处理数据。做了DBA1小鼠胶原诱导的模型，处理脾细胞。染色CD4 FITC, IFN-γ APC, IgG1 APC做同型，IL-4 PE, IgG1 PE做同型，都为eBioscience。固定破膜液fix&perm是life technologies公司。
步骤：1.处理脾细胞，制备成悬液，浓度为1.5×10^6/ml,培养箱孵育48h;
          2.各取100ul细胞，加入2ul CD4 FITC,避光，室温 15min（②、⑦、⑧）;
          3.再加入100ul fix&perm A液,避光，室温 15min（②、⑦、⑧）；
          4.加入4℃ PBS 3ml，300rcf ,5min,离心去上清（②、⑦、⑧）；
          5.各取100ul细胞，加入100ul fix&perm A液,避光，室温 15min（③、④、⑤、⑥）；
          6.加入4℃ PBS 3ml，300rcf ,5min,离心去上清（③、④、⑤、⑥）；
          7.除单染CD4的②管，其他管加入100ul fix&perm B液,及相应抗体染色，避光，室温 15min；
          8.加入4℃ PBS 3ml，300rcf ,5min,离心去上清；
          9.各管加入500ul PBS重悬，上机检测。
【①：空白；②：CD4 FITC;③：IFN-γ APC;④：IFN-γ 同型；⑤：IL-4 PE；⑥：IL-4同型；⑦：CD4+IFN;⑧：CD4+IL-4】
因为动物可见关节畸形，肿胀。认为模型是成功的，所以取细胞后，就没加刺激剂处理。结果IFN和IL-4都没染上，不知道是不是自己不会调数据，还是真的没染上，而且CD4细胞的比例也不高。之前有同学用BD FACSCalibur 帮我检测，数据也是她一起处理，CD4的比例都能达大二十几三十的，不过那是正常的小鼠脾细胞。想请教下，是否我的方案有错？一直都染不上

还有就是我做的是要加某种药物，作用48小时后，看Th1/Th2比例变化，但PMA和BFA有作用时间限时，那我该怎么处理呢？

niwanmao

1、方案错误，CD4并非淋巴细胞特异性标记，需再加上CD3才行。
2、设门错误，FSC和SSC都必须用LIN方式显示，而不是LOG，你这样的门设在那里，可能圈的是红细胞或血小板。

熊爱吃西瓜

谢谢老师的回复。可之前看了别人的Th1和Th2的流式方案，还有联科生物他们推荐的方案，都是直接用CD4，我主要也是想要检测IL-4和IFN-γ,而这两个因子是在CD4的亚群细胞标记，能否不加CD3？
我是用Biex设门，查了是说多色染的用这种设门比较好。刚刚改用了lin，可图片很奇怪。之前都是别人调数据好，自己第一次调数据，问的有些浅薄，望谅解。

chymanhz

如果Th1，Th2应该CD4就够了吧。你那张图需要放大，你要的细胞应该都在左下角

niwanmao

熊爱吃西瓜 发表于 2017-10-17 09:44
谢谢老师的回复。可之前看了别人的Th1和Th2的流式方案，还有联科生物他们推荐的方案，都是直接用CD4，我主 ...

CD4容易受到单核细胞干扰，所以我的建议是再加上CD3

至于图形，由于没有CD3，所以无法确定淋巴细胞位置，不知道你获取的时候是否又Log获取，如果以Log模式获取，有可能细胞跑到检测范围外面去了。

liuruiluna

除非你的样本颗粒大小相差得非常悬殊，用Lin无法看到好的分群，才用log试试看，一般都先跑个lin来做。
只能重新做一次，用lin来记录数据，设好阈值，去粘连体细胞，可以再加个看死活的指标

ghqiu09

log模式获取只能用log模式来分析？没试过，不清楚。我们的也是C6的仪器，每次分析淋巴细胞的时候，细胞群总是出现在fsc四百万的左右的位置，阈值甚至都设到50万，从图上看，那里几乎没细胞啊。