浸润淋巴细胞的流式检测

谱一首幸福

请教一个问题，我最近在做肿瘤浸润淋巴细胞的流式检测，做了很多次，一直都不分群，不知道为什么？抗体用的是bioleglend的牌子，分别是APC-CD3，FITC-CD8，PE-CD4，以下是我的操作步骤： 1、瘤子剪碎，用胶原酶VI，DNA酶，透明质酸酶消化1h后过细胞滤网，得到单细胞悬浮液 2、用含2%FBS的PBS洗涤细胞，再用其重悬细胞，于4度震荡10min后（封闭），离心，开始染色，染色是在bioleglend的staining buffer里面，四度的情况下震荡1h，再用stanning buffer洗两次之后上流式，但是用CD3（APC荧光通道）圈门之后，CD4和CD8细胞并没有分群，不知道为什么。 我是直接用的肿瘤细胞悬浮液，并未提取淋巴细胞；我看抗体说明书上说的都是每一百万个细胞需要多少抗体，抗体的量，我是按照这个加的，但是如果淋巴细胞含量少的话，抗体就会大大过量，会不会影响检测效果？后头我又提取了肿瘤浸润淋巴细胞染色试了一遍，还是没有分群的现象，我实在不知道问题出在哪里了，求大神帮助，感激不尽！顺便问一下，你们做肿瘤浸润淋巴细胞的检测是先提取淋巴细胞再染色，还是直接用肿瘤单细胞悬浮液染色？哪种比较好一些啊

[img]file:///C:\Users\高凡\AppData\Roaming\Tencent\Users\2573968226\QQ\WinTemp\RichOle\RVZV_1GBK(@[K_7K_5MHM)M.png[/img]

skywalker

你好，我来回答一下。
1.首先你的消化方式来看，可能不太适用于消化肿瘤。消化液我不了解，但是我用的不是这个。消化中，有没有在二氧化碳的孵箱里孵育，或者你可以选择水浴锅。
2. 你的panel里面没有加死活染料，因为肿瘤细胞在消化过程中有大量的死细胞，需要你染死活加以排除。你可以选择biolegend的僵尸染料，我用的是eb的死活染料。
3.你没有用CD45来gating Leukocytes。这会造成背景很高。
4. total T cells 只能是CD45+,CD3+,Side satter low的那群。
5.补偿，CD4 CD8 与CD3之间存在补偿。特别是PE 和 FITC 之间的补偿值，有的时候，会比较大，你调整了没有。
6.你在消化之后，有没有数过细胞。1million live cells per tube 进行染色。
7.你在染色之前，有没有blocking？
8. What's the tumor type？如果你的肿瘤是lymphoma，leukemia，你又要考虑是否本身肿瘤细胞就高表达某个异常的免疫细胞。
我从四色一直做到过16色，没有出现CD4,CD8无法分群的情况。可能会有一些双阳性。但是肿瘤浸润的淋巴细胞一定是可以分群的。因为他们是有功能的。
你做到以上我列的所有点，估计就可以分群了。谢谢

谱一首幸福

skywalker 发表于 2017-11-2 20:35
你好，我来回答一下。
1.首先你的消化方式来看，可能不太适用于消化肿瘤。消化液我不了解，但是我用的不是 ...

谢谢您的回答，深受启发，但我刚刚接触这些，还有些不是很理解，可以继续帮忙释疑一下吗？
1、这个消化方式是看文献上来的，我也问过医学院的人，用的这是这个消化方式，37℃振荡器种中进行的，应该没什么问题。
2、你说的死活染料和僵尸染料是什么？用这个排除死细胞会不会又增加了一色荧光？我之前见倪老师有个帖子说过用7-AAD Viability Staining Solution，在上机之前加入可以排除死细胞的干扰，用这个可以吗？
3、我只用CD3圈的门，可能会有些问题，至于您说的side satter low指的是什么呀？
4、补偿听说要用单阳管来做，具体的操作是什么样的，能否告知一下？
5、没管的细胞我都计数过，染色之前用的2%的FBS封闭过，因为买的封闭抗体还没到。您做的16色这个对流式的仪器要求非常高吧？我们流式比较简单，只有四个荧光通道，不知道如果加上做CD45做四色会不会相互干扰非常大。
6、问题比较多，麻烦您了

谱一首幸福

skywalker 发表于 2017-11-2 20:35
你好，我来回答一下。
1.首先你的消化方式来看，可能不太适用于消化肿瘤。消化液我不了解，但是我用的不是 ...

我用淋巴细胞提取试剂盒提取淋巴细胞再做流式，应该可以代替CD45圈门吧？

skywalker

谱一首幸福 发表于 2017-11-3 09:02
我用淋巴细胞提取试剂盒提取淋巴细胞再做流式，应该可以代替CD45圈门吧？ ...

那你可以用CD45圈门来试试看，到底问题出现在哪里。

liuruiluna

最好能把流式图发上来看一下，尤其是要带着FSC/SSC，这两个参数也能看到很多问题，包括每个管儿的电压参数、补偿参数的，虽然不一定有问题出在那里，但是便于分析问题

谱一首幸福

liuruiluna 发表于 2017-11-3 11:12
最好能把流式图发上来看一下，尤其是要带着FSC/SSC，这两个参数也能看到很多问题，包括每个管儿的电压参数 ...

已经上图，谢谢

liuruiluna

看上图 有两个问题，

1 FSC/SSC 圈门的面积占整个population已经不小了，却只占4.3%，这情况不太正常，阈值和电压需要考虑一下怎么回事儿。也许电压过高，导致把debirs看成了细胞。这也会直接导致后面的荧光信号不正确。
2.FL1和FL2貌似完全没有做补偿。 CD4 和CD8分别做的单色管是什么样？

谱一首幸福

liuruiluna 发表于 2017-11-3 12:56
看上图 有两个问题，

1 FSC/SSC 圈门的面积占整个population已经不小了，却只占4.3%，这情况不太正常，阈 ...

是的，还没有做补偿，因为不会做单色管

liuruiluna

http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... =%E8%A1%A5%E5%81%BF  

可以先学习一下。其实就是在测染三种抗体的检测管之前，跑一个 blank调电压、跑一个isotype看非特异性染色（不过站内多次提到isotype其实用处并不大，是观念问题，不如减色检测），再分别染三个管，每个管只染这三种中的一种荧光抗体，分别上机，并且调补偿，你这三个颜色就是FITC和PE做补偿，APC补偿很小。最最后，再上染了三种颜色的测试管。