怎么复苏才能使单个核细胞活力最好？

niwanmao

检测流式指标，当然新鲜采集样品首选，因为冷冻保存可能影响细胞的功能和表型。 不过话又说回来，提取单个核细胞（PBMCs）冻存后，检测时统一复苏，有助于减少操作者批间差异和室间差异，这在多中心临床试验中是比较常用的方法。

复苏步骤的优化，对于复苏后细胞的活力很重要。

丹麦的Bo Langhoff Hønge等人对复苏过程中各个存在变数的步骤进行了不同的摸索（如下图），优化结果发表在2017年11月1日的PLOS ONE上。


评估方法采用CD45选取白细胞，然后用7-AAD标记死细胞，计算活细胞比例，如下图：



1、复苏时间
两种选择，37度水浴至部分融化（1分15秒左右）或完全融化（5分钟左右），均不影响PBMC绝对数和活力。

2、洗涤液的选择
对六种洗涤液进行了评估：BSS、FBS、PBS、RPMI、S-RPMI（小牛血清）、S-RPMI（人血清），其中FBS洗涤获得的PBMC活力最高（96.1％），不过与S-RPMI（人血清）、S-RPMI（小牛血清）还是比较接近的（分别为95.7％和95.2％）。不过，S-RPMI（小牛血清）的活PBMC细胞回收率最高。

3、洗涤液的温度
测试了20％S-RPMI（小牛血清）37度预热和4度预冷两种温度，预热到37度的洗涤液获得的PBMC活力比4度明显高（分别为96.9％和81.0％）。

4、PBMC和复苏洗涤液的混合方式
测试了两种混合方式：将PBMC倒入洗涤液、将洗涤液逐滴加入PBMC。两种方式无显著差异，获得的活PBMC比例分别为96.9％和96.1％。

5、离心温度
离心温度测试了20度和37度两种。两者无显著差异。

6、离心时间和离心力
测试了三种方式：500g×10分钟、300g×10分钟、300g×5分钟，三者获得活PBMC比例分别为95.3％、95.9％、95.8％，不过500g离心10分钟活PBMC的回收率最高。

7、孵育时间
第二次洗涤液重悬PBMC时，作者将PBMC置于5％CO_2、37度孵箱中测试了0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时。0.5小时和1小时获得的活PBMC比例最高，但回收率无显著差异。

总结
总结一下上面的内容，复苏时最佳的条件是使用20％S-RPMI（小牛血清），预热至37度，离心力和离心时间设置为500g×10分钟，最后PBMC的孵育37度30分钟～1小时。


你GET了没？


参考文献：
Bo Langhoff Hønge, et al. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE, 2017 Nov.1

Echomoon

哇，谢谢倪老师，1号冻存了1批PMMC，正想着看看如何复苏活率高

zhangyy

Get了！
非常有用!
原来做实验时，总觉得高转速会把细胞“转死”，现在看来，只要在合理转速之内，转速高了不仅不会“转死”细胞，还可以有更多的细胞得率~
另外，之前做实验时，总是想不起要将培养基预热，以后还是预热好，既然温度对复苏的细胞活性影响很大，对我分选后需要培养的细胞活性应该也是有影响的，因此以后要注意。
干货满满，再次感谢！

summer-suk

请问倪老师 复苏后测T细胞流式的话影响是否比较大？

niwanmao

summer-suk 发表于 2018-11-21 02:32
请问倪老师 复苏后测T细胞流式的话影响是否比较大？

问题不大，站内搜索OMIP，可以发现，很多免疫学方面的Protocol，都是针对冻存后复苏的细胞进行了，因为这样子批量处理，有助于检测的一致性。

summer-suk

niwanmao 发表于 2018-11-22 08:48
问题不大，站内搜索OMIP，可以发现，很多免疫学方面的Protocol，都是针对冻存后复苏的细胞进行了，因为这 ...

谢谢倪老师

普鲁卡因

那有没有如何冻存PBMC的好方法呢 倪老师

qingshi

我整天捯饬pbmc我能说这篇文章有问题吗？

niwanmao

qingshi 发表于 2019-5-2 22:57
我整天捯饬pbmc我能说这篇文章有问题吗？

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