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怎么复苏才能使单个核细胞活力最好?

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发表于 2017-11-3 19:14:41 | 显示全部楼层 |阅读模式

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检测流式指标,当然新鲜采集样品首选,因为冷冻保存可能影响细胞的功能和表型。 不过话又说回来,提取单个核细胞(PBMCs)冻存后,检测时统一复苏,有助于减少操作者批间差异和室间差异,这在多中心临床试验中是比较常用的方法。

复苏步骤的优化,对于复苏后细胞的活力很重要。

丹麦的Bo Langhoff Hønge等人对复苏过程中各个存在变数的步骤进行了不同的摸索(如下图),优化结果发表在2017年11月1日的PLOS ONE上。
屏幕快照 2017-11-03 下午6.47.25.png

评估方法采用CD45选取白细胞,然后用7-AAD标记死细胞,计算活细胞比例,如下图:
屏幕快照 2017-11-03 下午6.47.43.png


1、复苏时间
两种选择,37度水浴至部分融化(1分15秒左右)或完全融化(5分钟左右),均不影响PBMC绝对数和活力。

2、洗涤液的选择
对六种洗涤液进行了评估:BSS、FBS、PBS、RPMI、S-RPMI(小牛血清)、S-RPMI(人血清),其中FBS洗涤获得的PBMC活力最高(96.1%),不过与S-RPMI(人血清)、S-RPMI(小牛血清)还是比较接近的(分别为95.7%和95.2%)。不过,S-RPMI(小牛血清)的活PBMC细胞回收率最高。

3、洗涤液的温度
测试了20%S-RPMI(小牛血清)37度预热和4度预冷两种温度,预热到37度的洗涤液获得的PBMC活力比4度明显高(分别为96.9%和81.0%)。

4、PBMC和复苏洗涤液的混合方式
测试了两种混合方式:将PBMC倒入洗涤液、将洗涤液逐滴加入PBMC。两种方式无显著差异,获得的活PBMC比例分别为96.9%和96.1%。

5、离心温度
离心温度测试了20度和37度两种。两者无显著差异。

6、离心时间和离心力
测试了三种方式:500g×10分钟、300g×10分钟、300g×5分钟,三者获得活PBMC比例分别为95.3%、95.9%、95.8%,不过500g离心10分钟活PBMC的回收率最高。

7、孵育时间
第二次洗涤液重悬PBMC时,作者将PBMC置于5%CO_2、37度孵箱中测试了0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时。0.5小时和1小时获得的活PBMC比例最高,但回收率无显著差异。

总结
总结一下上面的内容,复苏时最佳的条件是使用20%S-RPMI(小牛血清),预热至37度,离心力和离心时间设置为500g×10分钟,最后PBMC的孵育37度30分钟~1小时。


你GET了没?


参考文献:
Bo Langhoff Hønge, et al. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE, 2017 Nov.1



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发表于 2017-11-6 13:36:39 | 显示全部楼层
哇,谢谢倪老师,1号冻存了1批PMMC,正想着看看如何复苏活率高
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发表于 2017-11-8 15:38:05 | 显示全部楼层
Get了!
非常有用!
原来做实验时,总觉得高转速会把细胞“转死”,现在看来,只要在合理转速之内,转速高了不仅不会“转死”细胞,还可以有更多的细胞得率~
另外,之前做实验时,总是想不起要将培养基预热,以后还是预热好,既然温度对复苏的细胞活性影响很大,对我分选后需要培养的细胞活性应该也是有影响的,因此以后要注意。
干货满满,再次感谢!
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发表于 2018-11-21 02:32:51 | 显示全部楼层
请问倪老师 复苏后测T细胞流式的话影响是否比较大?
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 楼主| 发表于 2018-11-22 08:48:10 | 显示全部楼层
summer-suk 发表于 2018-11-21 02:32
请问倪老师 复苏后测T细胞流式的话影响是否比较大?

问题不大,站内搜索OMIP,可以发现,很多免疫学方面的Protocol,都是针对冻存后复苏的细胞进行了,因为这样子批量处理,有助于检测的一致性。
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发表于 2018-11-22 12:55:29 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-11-22 08:48
问题不大,站内搜索OMIP,可以发现,很多免疫学方面的Protocol,都是针对冻存后复苏的细胞进行了,因为这 ...

谢谢倪老师
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发表于 2019-4-24 21:47:38 | 显示全部楼层
那有没有如何冻存PBMC的好方法呢 倪老师
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发表于 2019-5-2 22:57:08 来自手机 | 显示全部楼层
我整天捯饬pbmc我能说这篇文章有问题吗?
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 楼主| 发表于 2019-5-2 23:20:26 | 显示全部楼层
qingshi 发表于 2019-5-2 22:57
我整天捯饬pbmc我能说这篇文章有问题吗?

why not?将你正确的经验分享出来吧
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