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[其它] 14色鼠源肿瘤TILs 染色

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发表于 2017-11-12 11:22:41 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
大家好,本人因为一直从事用流式细胞术测试肿瘤里面浸润的免疫细胞的实验,在这方面,有一些实验的数据和大家分享。
肿瘤中浸润免疫细胞的分析,和血液相比,还是有很大的不同的。而且颜色越多,其实补偿就越大,得到的数据,就越有不准确的可能。总的来说,我认为十色是比较理想的,超过十色,对实验员配色,后期分析的技术要求可能就相对高一点。

下面是我最近做的一个数据。包括死活,一共有14个颜色。是一个同学配完色之后,让我给他做一个补偿的检验,总的来说,整个补偿的调整还算在合理地范围内。

因为当时跑样的时候,没有做辅助管,所以很多gating的位置无法确定,特别是PD-L1,所以就没有圈。

还有就是因为想节约时间,所以没有染foxp3,实际上,这是一个15色的panel。明天我会将整个FACS PANEL 放上来。
实验结果:
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTM0OTl8NjQ3YWQ4ZTFjMWYyODZmYWE1ODM0MDVjYzUyZmVlNzF8MTYzNTA0NzE4NA%3D%3D&request=yes&_f=.pdf


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参与人数 1流星 +10 收起 理由
niwanmao + 10 感谢分享

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组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2017-11-12 11:24:09 | 显示全部楼层
大家有什么需要我解释的地方,也可以在后面留言,非常乐意和大家一起讨论
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-11-13 08:40:25 | 显示全部楼层
感谢分享
Bangslabs、Spherotech流式微球,帮您做好仪器设置、QC、荧光定量、细胞周期
发表于 2017-11-13 10:02:32 | 显示全部楼层
skywalker 发表于 2017-11-12 11:24
大家有什么需要我解释的地方,也可以在后面留言,非常乐意和大家一起讨论  ...

感谢分享。

有个小疑问,里面的NK标记为什么用CD335,不用CD56?
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2017-11-13 11:04:37 | 显示全部楼层
感谢分享,上次您说您的消化瘤子的方式不一样,我那种方法死细胞确实很多,方便告知一下消化方法吗?
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 楼主| 发表于 2017-11-13 13:07:16 | 显示全部楼层
谱一首幸福 发表于 2017-11-13 11:04
感谢分享,上次您说您的消化瘤子的方式不一样,我那种方法死细胞确实很多,方便告知一下消化方法吗? ...

你好,我们消化的时候,一般使用的是美天旎的机器和它自带的酶来做的消化。如果你们的实验室没有采购这种机器,就无法使用这种方法。
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2017-11-13 13:59:02 | 显示全部楼层
谱一首幸福 发表于 2017-11-13 11:04
感谢分享,上次您说您的消化瘤子的方式不一样,我那种方法死细胞确实很多,方便告知一下消化方法吗? ...

酶消化这个帖子看过吗?http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
Bangslabs、Spherotech流式微球,帮您做好仪器设置、QC、荧光定量、细胞周期
发表于 2017-11-13 14:09:00 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2017-11-13 13:59
酶消化这个帖子看过吗?http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html

好的,谢谢
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2017-11-13 14:09:47 | 显示全部楼层
skywalker 发表于 2017-11-13 13:07
你好,我们消化的时候,一般使用的是美天旎的机器和它自带的酶来做的消化。如果你们的实验室没有采购这种 ...

哦,那个仪器我看了一下,要十几万呢,谢谢哈
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 楼主| 发表于 2017-11-13 20:27:21 | 显示全部楼层
谱一首幸福 发表于 2017-11-13 14:09
哦,那个仪器我看了一下,要十几万呢,谢谢哈

1.        Digestion solution by Miltenyi degestion machine(no need add DNase)
a.        Prepare Enzyme D by reconstitution of the lyophilized powder in each vial with 3 mL of RPMI 1640 or DMEM. Prepare aliquots of appropriate volume to avoid repeated freeze-thaw cycles. Store aliquots at –20 °C. This solution is stable for 6 months after reconstitution. For cell culture experiments subsequent to tissue dissociation, Enzyme D should be sterile filtered prior to aliquoted.
b.        Prepare Enzyme R by reconstitution of the lyophilized powder in the vial with 2.7 mL RPMI 1640 or DMEM. Prepare aliquots of appropriate volume to avoid repeated freeze-thaw-cycles. Store aliquots at –20 °C. This solution is stable for 6 months after reconstitution.
▲ Note: Make sure to thoroughly mix this suspension immediately before withdrawing the required reaction volume!
c.        Prepare Enzyme A by reconstitution of the lyophilized powder in the vial with 1 mL of Buffer A supplied with the kit. Do not vortex. Prepare aliquots of appropriate volume to avoid repeated freeze-thaw-cycles. Store aliquots at –20 °C. This solution is stable for 6 months after reconstitution.
d.        Prepare enzyme mix by adding 2.35 mL of RPMI 1640 or DMEM, 100 μL of Enzyme D, 50 μL of Enzyme R, and 12.5 μL of Enzyme A into a GentleMACS C-Tube.
e.        <0.6g tumor for 2.35 mL Digestion solution each C-Tube.


2.        Digestion solution from Invitrogen
a.        Weight Collagenase I,II,IV each 5mg,
b.        pour them into 10ml RPMI1640, Add 100ul of 100x DNase (20mg/ml),mix well,
c.        <0.6g tumor for 5 mL Digestion solution


3.        Digestion solution from Roche
a.        Re-suspend 5mg of Liberase (26 Wunsch Units/vial) in 15ml of RPMI1640.
b.        Re-suspend for <30min at 4℃ with gentle agitation. Add 150ul of 100x DNase (20mg/ml).

以上是我们比较常用的方法,但是消化肿瘤的活率跟很多因素有关系。比如和你得到的肿瘤的质量,大小的关系都非常大。
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