B细胞磁珠阴选

fitlao

请教各位做过磁珠阴选B细胞的高手，我们刚开始做磁珠阴选B细胞。分选磁珠、磁柱都是用的miltenyi的。获得B细胞后流式检测纯度不高70--80%。分析原因可能是分离的PBMC中混入红细胞，导致加入的磁珠量不足。但是如果增加磁珠剂量似乎每次实验的成本太高了！想请教各位一般10ml全血，分离PBMC后阴选B细胞，加入大约多少ul磁珠？（按大约10ml血获得1*10⁷PBMC计算）
或者说大家获得的PBMC中混有的RBC吗？影响分离效果吗？如何解决？

miliamlau

磁珠阴选流出红细胞的可能性很小，因为阴选的cocktail中含有Ter-119，足够让红细胞挂在柱上。更可能是你的抗体cocktail效价有问题。
效价降低对于阳选还算可以容忍，但对阴选就不能，因为阴选就是靠强结合（一般靠间标）让所有疑似非目标细胞都挂柱去除，用得率换纯度。一旦效价降低，非目标细胞就会大量混入。
我遇到过这种事情，客户自己买的Treg纯化试剂盒在我们的AutoMACS上表现一塌糊涂，把CD4 T阴选的cocktail换了一瓶就没事了。毕竟不是所有代理商都有全程冷链，说不定什么时候就中招。

至于磁珠用量嘛，按我在HKU的经验，在说明书的基础上，用量和体积都减半，也没有问题。

fitlao

@miliamlau 看了下说明，我用的里面没有Ter-119。这个 CD235a (GlycophorinA)是不是结合红细胞的，能起到与Ter-119同样的作用？谢谢！！

liuruiluna

对， CD235a也是用于去除红细胞常用的抗体，一般来说，如果你已经将全血处理为PBMC这一步没有太大问题，都不会因为有残留红细胞而影响磁珠分选的，可能需要找找其他原因，比如分离了PBMC之后清洗的步骤怎样，最好是用足够量的PBS彻底清洗了两遍，这样使血小板去除的更干净一些，血小板很黏，残留过多会使影响磁珠分选效果。另外就是这个血样是否是正常人血液，细胞比例是否有变化，如果有也可以适当调整加试剂的量。调整试剂的量需要将抗体和磁珠按比例增加或减少，不能只改变磁珠的用量，没有抗体连接细胞，只调整磁珠的量没什么意义。